Mauruuru koe mo te toro ki Nature.com.Ko te putanga pūtirotiro e whakamahia ana e koe he iti te tautoko CSS.Mo te wheako pai rawa atu, e taunaki ana matou me whakamahi koe i tetahi kaitirotiro kua whakahoutia (me monohia ranei te Aratau Hototahi ki Internet Explorer).I tenei wa, hei whakarite i te tautoko tonu, ka tukuna e matou te waahi kaore he momo me te JavaScript.
Ko nga ira ira mo te maimoatanga o te pulmonary cystic fibrosis me aro ki nga ara rere, na te mea karekau he hua whakaora i te whakawhitinga o te manawa.Ko te kaha o te whakawhitinga viral e pa ana ki te wa noho o te kaikawe.Heoi, ko nga wai tuku penei i nga kawe ira ka rere noa ki roto i te alveoli i te wa e ngotea ana, a ka tere te tango i nga matūriki rongoa ahakoa he aha te ahua e te kawe mucociliary.He mea nui te whakaroa i te wa noho o nga kai kawe ira i roto i te rewharewha engari he uaua ki te whakatutuki.Ka taea e nga matūriki autō kua honoa e te kawe ka taea te toro atu ki te mata o te rewharewha te whakapai ake i te whainga rohe.Na nga raru o te whakaahua i roto i te vivo, ko te whanonga o nga matūriki autō iti i runga i te mata o te rangi i te aroaro o te papa autō kua tonohia, kare e tino marama.Ko te whainga o tenei rangahau ko te whakamahi i te whakaahua synchrotron ki te whakaata i roto i te vivo te neke o te raupapa matūriki autō i roto i te trachea o nga kiore whakangao ki te ako i te hihiri me nga tauira o te whanonga o nga matūriki kotahi me te nuinga o te matūriki i roto i te vivo.I arotakehia ano e matou mehemea ka nui ake te pai o te tuku matūriki autō lentiviral i te aroaro o te papa autō.Ka whakaatuhia e te Synchrotron X-ray atahanga te whanonga o nga matūriki autō i roto i nga papa autō e tu ana me te neke i roto i te vitro me te in vivo.Ko nga matūriki e kore e ngawari ki te toia ki runga i te mata o nga huarahi rererangi ma te whakamahi i nga aukume, engari i te wa e kawe ana, ka aro nga putunga ki te waahi tirohanga, kei reira te kaha o te papa aukume.I piki ano te pai o te whakawhiti kia ono nga wa ka tukuna nga matūriki autō lentiviral i te aroaro o te papa autō.Ko enei hua e kii ana ko nga matūriki autō lentiviral me nga papa autō he huarahi whai hua hei whakapai ake i te whainga ira ira me nga taumata whakawhiti i roto i nga huarahi rererangi i roto i te vivo.
Ko te Cystic fibrosis (CF) ka puta mai i nga rereketanga o te ira kotahi e kiia ana ko te CF transmembrane conductance regulator (CFTR).Ko te pūmua CFTR he hongere katote kei roto i te maha o nga pūtau epithelial puta noa i te tinana, tae atu ki nga huarahi rererangi, he waahi nui i roto i te pathogenesis o te cystic fibrosis.Ko nga hapa i roto i te CFTR ka arahi ki te kawe wai rerekee, te maroketanga o te mata o te huarahi rererangi, me te heke o te hohonu o te paparanga wai o te mata o te rangi (ASL).Ka whakararu hoki i te kaha o te punaha kawe mucociliary (MCT) ki te whakakore i nga huarahi rererangi o nga matūriki me nga pathogens.Ko ta matou whainga ko te whakawhanake i te rongoa ira lentiviral (LV) ki te tuku i te kape tika o te ira CFTR me te whakapai ake i te hauora ASL, MCT, me te pūkahukahu, me te whakawhanake tonu i nga hangarau hou hei ine i enei tawhā i roto i te vivo1.
Ko nga vectors LV tetahi o nga kaitono matua mo te rongoa ira ira cystic fibrosis, na te mea ka taea e ratou te whakauru tuturu i te ira rongoa ki roto i nga ruma o te ararere (rerenga-a-whare).He mea nui tenei na te mea ka taea e ratou te whakahoki mai i te whakamaarama me te maatanga o te hūpē ma te rereke ki roto i nga pūtau mata ararere kua whakatikahia e te ira e pa ana ki te cystic fibrosis, ka puta mai he painga mo te oranga.Me toro atu nga vectors LV ki nga huarahi rererangi, na te mea i konei ka timata te urunga o te huhu ki te CF.Ko te tukunga o te vector hohonu ki roto i te pukahukahu ka hua pea te whakawhitinga o te alveolar, engari karekau he hua whakaora mo te cystic fibrosis.Heoi ano, ko nga wai penei i nga kaikawe ira ka heke ki roto i te alveoli i te wa e ngohia ana i muri i te whanautanga3,4 ka tere te pana atu o nga matūriki rongoa ki roto i te waha waha e nga MCTs.Ko te kaha o te whakawhiti LV e hono tika ana ki te roa o te wa e noho tata ana te vector ki nga pūtau whainga kia taea ai te tango i te pūkoro - "wa noho" 5 e ngawari ana te whakapoto e te rere o te hau a-rohe me te ruruku o te hūpē me te matūriki MCT.Mo te cystic fibrosis, he mea nui te kaha ki te whakaroa i te wa noho LV i roto i nga huarahi rererangi ki te whakatutuki i nga taumata teitei o te whakawhiti i tenei waahi, engari he uaua ki tenei wa.
Ki te hinga i tenei arai, e whakaaro ana matou ka taea e nga matūriki autō LV (MP) te awhina i nga huarahi e rua.Tuatahi, ka taea te arahi e te aukume ki te mata o te ara rererangi hei whakapai ake i te whainga me te awhina i nga matūriki kawe ira kia noho ki te waahi tika o te huarahi rererangi;me te ASL) ka nuku ki te paparanga pūtau 6. Ka whakamahia whānuitia nga mema paremata hei waka tuku raau taero i te wa e herea ana ki nga paturopi, ki nga raau taero chemotherapy, ki etahi atu ngota ngota iti e piri ana ki nga kiriuhi pūtau, e herea ana ranei ki o ratou ake kaiwhakawhiwhi o te mata o te pūtau me te whakaemi ki nga waahi pukupuku i roto te aroaro o te hiko pateko.Nga mara autō mo te rongoa mate pukupuku 7. Ko etahi atu tikanga "hyperthermic" e whai ana ki te patu i nga pūtau puku ma te whakamahana i nga mema paremata ina pa ana ki nga papa autō oscillating.Ko te maataapono o te whakawhiti autō, e whakamahia ai te papa autō hei kaihoko whakawhiti ki te whakarei ake i te whakawhitinga o te DNA ki roto i nga pūtau, ka whakamahia i roto i te vitro ma te whakamahi i nga momo ira ira kore-viral me viral mo nga raina pūtau uaua-ki-whakawhiti. ..Ko te kaha o te LV magnetotransfection me te tuku LV MP in vitro ki roto i te raina pūtau o te epithelium bronchial tangata i te aroaro o te papa autō pateko i whakapumautia, ka piki ake te kaha o te whakawhiti ma te 186 nga wa ka whakaritea ki te LV vector anake.Kua tukuna ano te LV MT ki te tauira in vitro o te cystic fibrosis, i reira ka nui ake te whakawhitinga LV i roto i nga ahurea atanga hau-wai ma te tauwehe o te 20 i te aroaro o te cystic fibrosis sputum10.Heoi, i roto i vivo okana magnetotransfection he iti noa te aro, a kua arotakehia i roto i etahi rangahau kararehe11,12,13,14,15, ina koa i roto i nga ngongo16,17.Heoi ano, he maamaa nga huarahi e taea ai te whakawhiti autō i roto i te rongoa pūkahukahu i roto i te cystic fibrosis.Tan et al.(2020) i kii ko "te rangahau whakamana mo te tuku puohu whai hua o nga nanoparticles autō ka para i te huarahi mo nga rautaki inhalation CFTR a meake nei hei whakapai ake i nga hua haumanu i nga turoro me te cystic fibrosis"6.
Ko te whanonga o nga matūriki autō iti i runga i te mata o te rewharewha i te aroaro o te papa autō kua whakamahia he uaua ki te tiro me te ako, na reira kaore i te tino maarama.I etahi atu rangahau, kua whakawhanakehia e matou he tikanga Whakatairanga i runga i te Synchrotron Propagation Based Phase Contrast X-Ray Imaging (PB-PCXI) mo te atahanga kore-invasive me te ine o nga meneti i roto i nga huringa vivo i roto i te hohonu o te ASL18 me te whanonga MCT19,20 ki te ine tika i te wai o te mata o te hongere hau. ka whakamahia hei tohu moata mo te whai huatanga o te maimoatanga.I tua atu, ko ta maatau tikanga tohu MCT e whakamahi ana i nga matūriki diameter 10–35 µm i titoa mai i te alumina, i te karaehe tohu whakaata teitei ranei hei tohu MCT ka kitea me te PB-PCXI21.He pai nga tikanga e rua mo te whakaahua i nga momo matūriki, tae atu ki nga mema MP.
Na te nui o te whakataunga mokowhiti me te waahi, ko o maatau ASL me te MCT a PB-PCXI he mea tino pai ki te ako i nga hihiko me nga tauira whanonga o nga matūriki kotahi me te nuinga i roto i te vivo hei awhina i a maatau ki te mohio me te arotau i nga tikanga tuku ira MP.Ko te huarahi e whakamahia ana e matou i konei i ahu mai i a maatau rangahau ma te whakamahi i te raina kurupae SPring-8 BL20B2, i kite ai matou i te nekehanga wai i muri i te tukunga o te horopeta o te wawao puhoi ki roto i nga ara o te ihu me te pulmonary o nga kiore hei awhina i te whakamaarama i o maatau tauira whakaputanga ira rereke i kitea. i roto i to tatou ira.rangahau kararehe ki te horopeta kawe o 3.4.
Ko te whainga o tenei rangahau ko te whakamahi i te PB-PCXI synchrotron ki te tiro i roto i nga nekehanga ora o te raupapa o nga mema paremata i roto i te pukoro o nga kiore ora.I hangaia enei rangahau whakaahua PB-PCXI ki te whakamatautau i te raupapa MP, te kaha o te papa autō, me te waahi ki te whakatau i to raatau paanga ki te nekehanga MP.I whakaaro matou ma te papa autō o waho ka awhina i te MF kua tukuna ki te noho, ki te neke ranei ki te waahi kua tohua.I taea hoki e enei rangahau te whakatau i nga whirihoranga aukume hei whakanui ake i te nui o nga matūriki e toe ana ki roto i te trachea i muri i te tukunga.I roto i te raupapa tuarua o nga rangahau, i whai matou ki te whakamahi i tenei whirihoranga tino pai ki te whakaatu i te tauira whakawhiti i puta mai i te tuku in vivo o nga LV-MPs ki nga huarahi rererangi kiore, i runga i te whakaaro ko te tukunga o nga LV-MP i roto i te horopaki o te whainga rererangi ka puta. i roto i te whakanui ake i te kaha whakawhiti LV..
I whakahaerehia nga rangahau kararehe katoa i runga i nga tikanga kua whakaaetia e te Whare Wananga o Adelaide (M-2019-060 me M-2020-022) me te SPring-8 Synchrotron Animal Ethics Committee.I whakahaerehia nga whakamatautau i runga i nga taunakitanga a ARRIVE.
Ko nga whakaahua x-ray katoa i tangohia i te BL20XU beamline i te SPring-8 synchrotron i Japan ma te whakamahi i te tatūnga rite ki tera i whakaahuahia i mua21,22.I te wa poto, ko te pouaka whakamatautau kei te 245 m mai i te mowhiti rokiroki synchrotron.He 0.6 mita te tawhiti o te tauira-ki-te-kitenga mo nga rangahau whakaahua matūriki me te 0.3 m mo nga rangahau whakaahua in vivo hei hanga i nga paanga rereke o te waahanga.I whakamahia he kurupae monochromatic me te kaha o te 25 keV.I whiwhihia nga whakaahua ma te whakamahi i te kaiwhakawhiti hihi X-ray taumira teitei (SPring-8 BM3) i honoa ki te kaitirotiro sCMOS.Ka huri te kaiwhakawhitiwhiti i nga hihi-X ki te marama ka kitea ma te whakamahi i te scintillator 10 µm matotoru (Gd3Al2Ga3O12), ka tukuna ki te pukoro sCMOS ma te whakamahi i te whainga karukaru ×10 (NA 0.3).Ko te kaitirotiro sCMOS he Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japan) me te rahi huinga o te 2048 × 2048 pika me te rahi pika mata o 6.5 × 6.5 µm.Ka hoatu e tenei tautuhinga te rahi o te pika isotropic whaihua o te 0.51 µm me te waahi tirohanga tata ki te 1.1 mm × 1.1 mm.Ko te roanga o te whakakitenga o te 100 ms i whiriwhiria hei whakanui ake i te owehenga tohu-ki-haruru o nga matūriki autō i roto, i waho hoki o nga huarahi rererangi me te whakaiti i nga mahi toi na te manawa.Mo nga rangahau i roto i te vivo, i whakanohohia he marumaru X-ray tere ki te ara X-ray hei whakawhāiti i te horopeta iraruraru ma te aukati i te kurupae X-ray i waenga i nga whakaaturanga.
Kaore i whakamahia te päpäho LV i roto i nga rangahau atahanga SPring-8 PB-PCXI na te mea ko te ruma atahanga BL20XU ehara i te Tiwhikete Koiora Taumata 2.Engari, i whiriwhiria e matou he maha o nga mema paremata kua tino tohuhia mai i nga kaihoko hokohoko e rua e hipoki ana i te whānuitanga o nga rahi, nga rawa, te kukū rino, me nga tono , — tuatahi kia mohio ai me pehea te paanga o nga papa autō ki te nekehanga o nga mema i roto i nga karaehe karaihe, katahi ka nga rererangi ora.mata.He rereke te rahi o te MP mai i te 0.25 ki te 18 µm, he mea hanga mai i nga momo rauemi (tirohia te Ripanga 1), engari ko te hanganga o ia tauira, tae atu ki te rahi o nga matūriki autō i roto i te MP, kaore i te mohiotia.I runga i a maatau rangahau MCT whanui 19, 20, 21, 23, 24, ko te tumanako ka kitea nga mema paremata ki raro ki te 5 µm i runga i te mata o te arai hau, hei tauira, ma te tango i nga papa karapīpiti kia kitea te pai ake o te tirohanga o te nekehanga MP.Ko te MP kotahi o te 0.25 µm he iti ake i te taumira o te taputapu atahanga, engari ko te PB-PCXI e tika ana kia kitea te rereketanga o te reo me te nekehanga o te wai mata e takoto ana i muri i te tuunga.
He tauira mo ia mema paremata i te ripanga.1 i whakaritea i roto i te 20 μl capillaries karaihe (Drummond Microcaps, PA, USA) me te diameter o roto o 0.63 mm.Kei te waatea nga matūriki tinana i roto i te wai, ko nga matūriki CombiMag kei roto i te wai rangatira o te kaihanga.Ka whakakiia ia ngongo ki te haurua ki te wai (tata ki te 11 µl) ka utaina ki runga i te putunga tauira (tirohia te Whakaahua 1).Ko nga capillaries karaehe i tuu whakapae ki runga i te atamira i roto i te ruma atahanga, ka tuu ki nga taha o te wai.He 19 mm te diameter (28 mm te roa) nickel-shell magnet i hangaia mai i te whenua onge, neodymium, rino me te boron (NdFeB) (N35, cat. No. LM1652, Jaycar Electronics, Ahitereiria) me te remanence o te 1.17 T i piri ki tetahi tepu whakawhiti motuhake hei whakatutuki Huri Mamao i to tuunga i te wa tuku.Ka timata te whakaahua hihi-X i te wa e tu ana te aukume ki te 30 mm ki runga ake o te tauira ka riro mai nga whakaahua i te 4 papa mo ia hekona.I te wa o te atahanga, ka tatahia te aukume ki te ngongo kapi karāhe (i te tawhiti o te 1 mm) ka neke haere i te taha o te ngongo ki te aromatawai i te paanga o te kaha me te tuunga o te mara.
He tatūnga atahanga in vitro kei roto nga tauira MP i roto i nga karaehe karaehe i te wa o te whakamaoritanga o te tauira xy.Ko te ara o te kurupae X-ray kua tohua ki te raina iraira whero.
I te wa i whakapumautia ai te tirohanga in vitro o nga mema paremata, ka whakamatauria he wahanga o ratou i roto i te vivo ki nga kiore Wistar albino wahine momo mohoao (~12 wiki te pakeke, ~200 g).Medetomidine 0.24 mg / kg (Domitor®, Zenoaq, Japan), midazolam 3.2 mg / kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Japan) me te butorphanol 4 mg / kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Ko nga kiore i whakanekehia ki te ranunga Pharma (Japan) ma te werohanga intraperitoneal.I muri i te mate whakamohoatanga, ka rite ratou mo te whakaahua ma te tango i te huruhuru huri noa i te trachea, me te whakauru i te ngongo endotracheal (ET; 16 Ga intravenous cannula, Terumo BCT), me te whakakorikori i a ratou i runga i te pereti atahanga kua oti te hanga he putea waiariki. ki te pupuri i te pāmahana tinana.22. Katahi ka whakapiria te pereti atahanga ki te atamira tauira i roto i te pouaka whakaata i te koki paku ki te whakaroa i te pukoro ki runga i te ahua x-ray e whakaatuhia ana i te Whakaahua 2a.
(a) In vivo tatūnga atahanga i roto i te waeine atahanga SPring-8, ara kurupae X-ray kua tohua ki te raina iraira whero.(b, c) I mahia te whakamaaramatanga o te aukume o te tracheal ma te whakamahi i nga kamera IP e rua.I te taha maui o te ahua i runga i te mata, ka kite koe i te waea waea e mau ana i te mahunga me te cannula tuku kua whakauruhia ki roto i te ngongo ET.
I honoa tetahi punaha papu syringe mamao (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) ma te whakamahi i te syringe karaihe 100 µl ki te ngongo PE10 (0.61 mm OD, 0.28 mm ID) ma te whakamahi i te ngira 30 Ga.Tohua te ngongo kia tika te tuunga o te pito ki roto i te pukoro ina whakaurua te ngongo endotracheal.Ma te whakamahi i te micropump, ka tangohia te plunger syringe ka rukuhia te pito o te ngongo ki te tauira MP ka tukuna.Ka kuhuhia te ngongo tuku utaina ki roto i te ngongo endotracheal, ka tuu te pito ki te wahi tino kaha o to maatau papa autō e tumanakohia ana.I whakahaeretia te tango atahanga ma te whakamahi i te puihi manawa e hono ana ki to maatau pouaka wa-a-Arduino, me nga tohu katoa (hei tauira, te mahana, te manawa, te marumaru tuwhera/kati, me te hopu whakaahua) i tuhia ma te whakamahi i te Powerlab me te LabChart (AD Instruments, Sydney, Australia) 22 I te wa e whakaahua ana I te korenga o te whare, e rua nga kamera IP (Panasonic BB-SC382) i tuu ki te 90° ki a raua, ka whakamahia hei whakahaere i te tuunga o te aukume e pa ana ki te trachea i te wa e whakaahua ana (Whakaahua 2b, c).Hei whakaiti i nga mahi toi motini, kotahi te ahua mo ia manawa i riro i te waa o te papa rewharewha kapeka.
Ka piri te aukume ki te waahanga tuarua, tera pea kei waho o te tinana whakaahua.He maha nga tuunga me nga whirihoranga o te aukume i whakamatauria, tae atu ki: ka tuu ki te koki tata ki te 30° ki runga ake o te pukoro (kei te whakaatuhia nga whirihoranga i nga Whakaahua 2a me te 3a);Ko tetahi aukume kei runga ake i te kararehe me tetahi kei raro, me nga pou kua whakaritea hei kukume (Whakaahua 3b)., kotahi aukume kei runga ake i te kararehe me tetahi kei raro, me nga pou kua whakatakotoria mo te whakakore (Whakaahua 3c), me tetahi aukume kei runga ake, e noho tika ana ki te trachea (Whakaahua 3d).Whai muri i te whakaturanga o te kararehe me te aukume me te utaina o te MP i raro i te whakamatautau ki roto i te papu syringe, tukuna he horopeta 50 µl i te tere o te 4 µl/hekona i te wa i riro mai ai nga whakaahua.Ka nekehia te aukume ki muri, whakamuri ma te taha o te trachea ranei i te wa e mau tonu ana nga whakaahua.
Te whirihoranga aukume mo te atahanga in vivo (a) kotahi aukume kei runga ake i te trachea i te koki tata ki te 30°, (b) e rua nga aukume i whirihora mo te kukume, (c) e rua nga aukume i whirihora mo te pana, (d) kotahi aukume kei runga ake, e tika ana ki te pukoro.I titiro iho te kaitirotiro mai i te waha ki nga ngongo i roto i te trachea ka haere te kurupae X-ray ki te taha maui o te kiore ka puta ki te taha matau.Ka nekehia te aukume ki runga i te roa o te ara rererangi, ki te taha maui me te taha matau ranei i runga ake o te trachea ki te ahunga o te kurupae X-ray.
I rapu ano matou ki te whakatau i te tirohanga me te whanonga o nga matūriki i roto i nga huarahi rererangi i te kore o te ranu o te manawa me te tere o te ngakau.Na reira, i te mutunga o te wa atahanga, ka whakakorehia nga kararehe na te pentobarbital overdose (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~ 65 mg / kg ip).Ka waiho etahi kararehe ki runga i te papa whakaahua, a, i muri i te whakamutua o te manawa me te paheketanga o te ngakau, ka tukuna ano te mahi whakaahua, me te taapiri atu i te horopeta MP mena karekau he MP i kitea i runga i te mata o te rangi.
I whakatikahia nga whakaahua mo te papa papatahi me te pouri, katahi ka whakaemihia ki roto i te kiriata (20 papa mo ia hekona; 15–25 × tere noa i runga i te reanga manawa) ma te whakamahi i te tuhinga ritenga kua tuhia ki MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Ko nga rangahau katoa mo te tuku ira ira LV i whakahaerehia i te Whare Wananga o Adelaide Laboratory Animal Research Center me te whai ki te whakamahi i nga hua o te whakamatautau SPring-8 ki te aromatawai mehemea ka taea e te tuku LV-MP i te aroaro o te papa autō te whakarei ake i te whakawhitinga ira i roto i te vivo .Hei arotake i nga paanga o te MF me te papa autō, e rua nga roopu kararehe i rongoahia: kotahi te roopu i werohia ki te LV MF me te whakanoho aukume, ko tetahi atu roopu i werohia ki te roopu whakahaere me te LV MF kaore he aukume.
LV ira vectors have been generated using the previous describes ways 25, 26 .Ko te vector LacZ e whakaatu ana i te ira peta-galactosidase karihi e peia ana e te kaiwhakatairanga kaupapa MPSV (LV-LacZ), e whakaputa ana i te hua tauhohenga kikorangi i roto i nga pūtau whakawhiti, ka kitea ki mua me nga waahanga o te kiko o te huhu.I mahia te titration i roto i nga ahurea pūtau ma te tatau a-ringa i te maha o nga pūtau LacZ-positive ma te whakamahi i te hemocytometer hei tatau i te titer i TU/ml.Ka tiakina nga kaikawe ki te -80°C, ka whakamarokehia i mua i te whakamahi, ka herea ki CombiMag ma te whakaranu i te 1:1 me te whakamau ki runga tio mo te 30 meneti i mua i te tuku.
Ko nga kiore Sprague Dawley noa (n = 3 / roopu, ~ 2-3 ip kua whakahiatohia me te ranunga o 0.4mg / kg medetomidine (Domitor, Ilium, Ahitereiria) me te 60mg / kg ketamine (Ilium, Ahitereiria) i te 1 marama o te tau) ip ) werohia me te kano-waha-kore-haparapara me te 16 Ga ira.Ki te whakarite kia whiwhi te kiko o te rewharewha ki te whakawhiti i te LV, i whakatauhia ma te whakamahi i ta maatau kawa whakamaarama miihini i whakaahuahia i mua ake nei i pania ai te mata o te ara o te rangi ma te kete waea (N-Circle, tangohanga kohatu nitinol kaore he matamata NTSE-022115) -UDH , Cook Medical, USA) 30 p28.Na, tata ki te 10 meneti i muri mai i te raruraru i roto i te rūnanga haumaru koiora, ka mahia te whakahaere awha o LV-MP.
He rite tonu te whirihora o te papa autō i whakamahia i roto i tenei whakamatautau ki te rangahau x-ray in vivo, me nga aukume ano e mau ana ki runga i te trachea me nga awhi stent whakamaarama (Whakaahua 4).He 50 µl rōrahi (2 x 25 µl aliquots) o te LV-MP i tukuna ki te trachea (n = 3 kararehe) ma te whakamahi i te pipette mata-rere pera i te korero o mua.Ko te roopu whakahaere (n = 3 kararehe) i whiwhi i taua LV-MP me te kore whakamahi i te aukume.I muri i te otinga o te whaowhia, ka tangohia te cannula mai i te ngongo endotracheal, ka werohia te kararehe.Ka noho tonu te aukume mo te 10 meneti i mua i te tango.Ko nga kiore i tukuna i raro i te kiri ki te meloxicam (1 ml / kg) (Ilium, Ahitereiria) ka whai i te tangohanga o te mate ma te werohanga intraperitoneal o 1 mg / kg atipamazole hydrochloride (Antisedan, Zoetis, Ahitereiria).Ka whakamahanahia nga kiore, ka matakihia kia ora ra ano i te mate rewharewha.
He taputapu tuku LV-MP i roto i te rūnanga haumaru koiora.Ka kite koe ka puta mai i te waha te karekau mauka o Luer hina hina o te ngongo ET, ka kuhuhia te pito paipa tiera e whakaatuhia ana i roto i te ngongo ET ki te hohonutanga e hiahiatia ana ki roto i te pukoro.
Kotahi wiki i muri mai i te whakahaerenga whakahaere LV-MP, i patu tangata nga kararehe ma te inhalation o te 100% CO2 me te whakaaturanga LacZ i aromatawaihia ma te whakamahi i to maatau maimoatanga X-gal paerewa.Ko nga mowhiti cartilage e toru te nuinga o te caudal i tangohia ki te whakarite kia kore e uru ki roto i te tātaritanga nga kino miihini, te pupuri wai ranei na te tuunga ngongo endotracheal.I tapahia ia trachea kia roa kia rua nga haurua hei tātari, ka maka ki roto i te kapu he rapa silicone (Sylgard, Dow Inc) ma te whakamahi i te ngira Minutien (Utauta Putaiao Pai) hei tiro i te mata maramara.Ko te tohatoha me te ahuatanga o nga pūtau whakawhiti i whakapumautia e te whakaahua o mua ma te whakamahi i te miihini Nikon (SMZ1500) me te kamera DigiLite me te rorohiko TCapture (Tucsen Photonics, Haina).I riro mai nga whakaahua i te 20x te whakanui (tae atu ki te whakatakotoranga morahi mo te whanui tonu o te trachea), me te katoa o te roa o te trachea e whakaatuhia ana i ia taahiraa, kia nui te inaki i waenga i ia ahua kia taea ai te "tuia" nga whakaahua.Ko nga whakaahua mai i ia trachea ka honoa ki te ahua hiato kotahi ma te whakamahi i te Composite Image Editor putanga 2.0.3 (Microsoft Research) ma te whakamahi i te algorithm motion planar. Ko te waahi o te whakahuatanga LacZ i roto i nga whakaahua hiato o te tracheal mai i ia kararehe i ine ma te whakamahi i te tuhinga MATLAB aunoa (R2020a, MathWorks) pera i te korero o mua28, ma te whakamahi i nga tautuhinga 0.35 <Hue <0.58, Saturation> 0.15, me te Uara <0.7. Ko te waahi o te whakahuatanga LacZ i roto i nga whakaahua hiato o te tracheal mai i ia kararehe i ine ma te whakamahi i te tuhinga MATLAB aunoa (R2020a, MathWorks) pera i te korero o mua28, ma te whakamahi i nga tautuhinga 0.35 <Hue <0.58, Saturation> 0.15, me te Uara <0.7. Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была количественно определена с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0 ,7. Ko te waahi o te whakaaturanga LacZ i roto i nga whakaahua tracheal hiato mai ia kararehe i ine ma te whakamahi i te tuhinga MATLAB aunoa (R2020a, MathWorks) pera i te whakaahuatanga o mua28 ma te whakamahi i nga tautuhinga 0.350.15 me te uara<0 .7.如 前所 述 述, 使用 自动 Mallab 脚本 (R2020a, Mathworks) 对 来自 每 只 图像 的 气管 复合复合 的中 的 复合 复合 图像 的 复合 复合 图像 的 复合 复合 图像 的中 的每 图像图像 的 复合 复合 图像 的进行 的每 图像图像 的 复合 复合复合 的中 的进行 的复合 的中 的 复合 复合 图像 的 复合 复合 图像 的进行 的气管 图像 的中 的 复合 复合 的 的进行 量化气管 图像图像量化, 区域区域 的进行, 区域 进行进行 量化量化, 区域区域 的进行, 使用 0.如 前所前所, 自动 自动 Mallab 脚本 ((R2020a, MathWorks) 来自 每 只 的 气管 复合 的 的 的 复合 量化, 使用 的使用 使用 使用量化, 使用 使用使用 使用 0.35 的 的 ..... ...................................... HIP Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определяли с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0,7 . Ko nga waahanga o te whakaaturanga LacZ i runga i nga whakaahua hiato o te trachea o ia kararehe i ine ma te whakamahi i te tuhinga MATLAB aunoa (R2020a, MathWorks) pera i whakaahuahia i mua ma te whakamahi i nga tautuhinga 0.35 <hue <0.58, waiwai > 0.15 me te uara <0.7.Ma te whai i nga ahua o te kiko i roto i te GIMP v2.10.24, i hangaia a ringatia he kanohi mo ia ahua hiato hei tautuhi i te waahi kiko me te aukati i nga kitenga teka kei waho o te kopa pukoro.Ko nga waahi kua pokea mai i nga whakaahua hiato katoa mai i ia kararehe i whakarapopotohia hei whakaatu i te katoa o te waahi poke mo taua kararehe.Ko te waahi peita ka wehea e te katoa o te waahi o te kanohi kia whiwhi i te waahi kua whakaritea.
Ko ia trachea ka kuhu ki roto i te parawini ka tapahia kia 5 µm te matotoru.Ko nga waahanga i parea ki te whero tere kore mo te 5 meneti ka riro mai nga whakaahua ma te whakamahi i te miihini Nikon Eclipse E400, kamera DS-Fi3 me te punaha hopu huānga NIS (putanga 5.20.00).
I mahia nga tātari tatauranga katoa i roto i te GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).I whakaritea te hiranga tatauranga ki te p ≤ 0.05.I whakamatauhia te tikanga ma te whakamahi i te whakamatautau Shapiro-Wilk me nga rereketanga o te taatai ​​​​LacZ i aromatawaihia ma te whakamahi i te whakamatautau-t kore takirua.
Ko nga mema paremata e ono e whakaahuatia ana i te Ripanga 1 i tirohia e te PCXI, a kua whakaahuatia te tirohanga ki te Ripanga 2. E rua nga mema polystyrene (MP1 me te MP2; 18 µm me 0.25 µm, ia) kaore i kitea e te PCXI, engari ko nga tauira e toe ana ka taea te tautuhi. (kei te Whakaatu 5 nga tauira).Ko te MP3 me te MP4 he ngoikore te kitea (10-15% Fe3O4; 0.25 µm me 0.9 µm, ia).Ahakoa kei roto i te MP5 (98% Fe3O4; 0.25 µm) etahi o nga matūriki iti rawa i whakamatauria, ko te mea tino whakahua.Ko te hua CombiMag MP6 he uaua ki te wehewehe.I nga ahuatanga katoa, i tino pai ake to maatau ki te kite i nga MF ma te neke i te aukume ki muri me te whakarara ki te kapi.I te nekenga atu o nga aukume i te kapi, ka toia nga matūriki ki waho i roto i nga mekameka roa, engari i te tata mai o nga aukume ka piki ake te kaha o te papa aukume, ka poto nga mekameka matūriki i te hekenga o nga matūriki ki te mata o runga o te kapi (tirohia te Ataata Tāpiri S1 : MP4), te whakanui ake i te kiato matūriki i te mata.Engari, ka tangohia te aukume mai i te kapi, ka heke te kaha o te mara, ka huri ano nga mema paremata ki nga mekameka roa ka toro atu i te mata o runga o te kapi (tirohia te Ataata Tāpiri S2: MP4).Ka mutu te neke o te aukume, ka neke tonu nga matūriki mo etahi wa i muri i te taenga ki te taurite.I te wa e neke haere ana te MP i te mata o runga o te kapi, ka kumea e nga matūriki autō te para i roto i te wai.
He rerekee te kitea o te MP i raro i te PCXI i waenga i nga tauira.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 me (d) MP6.Ko nga whakaahua katoa e whakaatuhia ana i konei i tangohia me te aukume i noho tata ki te 10 mm ki runga ake i te kapi.Ko nga porowhita nui he mirumiru hau e mau ana i roto i nga kapi, e whakaatu ana i nga ahuatanga o te taha pango me te ma o te ahua rereke.Ko te pouaka whero e tohu ana i te whakanui e whakanui ana i te rereke.Kia mahara ko nga diameter o nga iahiko aukume i roto i nga whika katoa kaore i te tauine, he tata ki te 100 nga wa nui ake i te whakaaturanga.
I te neke haere o te aukume ki te taha maui me te taha matau i te tihi o te kapi, ka huri te koki o te aho MP ki te hono ki te aukume (tirohia te Whakaahua 6), na reira ka tohu i nga rarangi papa autō.Mo te MP3-5, i muri i te ekenga o te chord ki te koki paepae, ka toia nga matūriki ki te mata o runga o te kapi.I te nuinga o te wa ka whakarōpū nga mema paremata ki roto i nga roopu nui tata ki te waahi e tino kaha ana te papa autō (tirohia te Ataata Tāpiri S3: MP5).Ka tino kitea ano tenei i te wa e tata ana te whakaahua ki te pito o te kapi, ka whakahiato te MP ki te atanga hau-wai.Ko nga matūriki o te MP6, he uaua ake ki te wehewehe i era o te MP3-5, kaore i toia i te wa e neke ana te aukume ki te taha o te kapi, engari ka wehe nga aho MP, ka waiho nga matūriki hei tirohanga (tirohia te Ataata Tāpiri S4: MP6).I etahi wa, i te whakahekenga o te papa aukume i whakamahia ma te neke i te aukume ki tawhiti mai i te waahi atahanga, ka heke haere nga toenga o nga mema paremata ki te mata o raro o te ngongo ma te kaha, ka noho ki roto i te aho (tirohia te Ataata Tāpiri S5: MP3) .
Ka huri te koki o te aho MP ina neke te aukume ki te taha matau ki runga ake o te kapi.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 me (d) MP6.Ko te pouaka whero e tohu ana i te whakanui e whakanui ana i te rereke.Kia mahara ko nga ataata taapiri mo nga kaupapa korero na te mea e whakaatu ana i te hanganga matūriki nui me nga korero hihiri e kore e taea te kite i enei whakaahua pateko.
Kua whakaatuhia e o maatau whakamatautau ko te neke haere i te aukume ki muri me te whakamuri i te taha o te trachea ka pai te tirohanga o te MF i roto i te horopaki o te nekehanga uaua i roto i te vivo.Karekau he whakamatautau in vivo i mahia na te mea kaore i kitea nga pirepire polystyrene (MP1 me te MP2) i roto i te capillary.Ko ia o nga MF e wha e toe ana i whakamatauria i roto i te vivo me te tuaka roa o te aukume i tuu ki runga i te trachea i te koki tata ki te 30° ki te poutū (tirohia te Whakaahua 2b me te 3a), na te mea i hua ake nga mekameka MF roa ake, he pai ake. atu i te aukume..ka mutu te whirihoranga.Ko te MP3, MP4 me te MP6 kaore i kitea i roto i te pukoro o nga kararehe ora.I te wa e tiro ana i te manawa o te kiore i muri i te patu tangata i nga kararehe, ka noho kore kitea nga matūriki ahakoa ka taapirihia etahi atu rōrahi ma te whakamahi i te papu syringe.Ko te MP5 te teitei o nga ihirangi rino waikura, ko ia anake te matūriki e kitea ana, na reira i whakamahia hei arotake me te tohu i te whanonga MP i roto i te vivo.
Ko te tuunga o te aukume ki runga i te trachea i te wa o te whakaurunga o te MF i hua he maha, engari kaore i te katoa, ko nga MF kua aro ki te waahi tirohanga.Ko te urunga mai o nga matūriki i roto i te pukoro ka tino kitea i roto i nga kararehe kua whakakorehia e te tangata.Whakaahua 7 me te Ataata Tāpiri S6: Ko te MP5 e whakaatu ana i te hopu tere autō me te whakahāngaitanga o nga matūriki ki runga i te mata o te puwharewha, e tohu ana ka taea e nga mema paremata te toro atu ki nga waahi e hiahiatia ana o te trachea.I te wa e rapu tawhiti atu ana i te pukoro i muri i te tukunga o te MF, ka kitea etahi MF e tata ana ki te carina, e tohu ana he iti rawa te kaha o te papa autō ki te kohikohi me te pupuri i nga MF katoa, i te mea i tukuna mai i roto i te rohe o te kaha o te papa autō i te wa e whakahaere ana te wai.tukanga.Heoi, he nui ake te kuhanga o te MP i muri i te whanautanga ki te taha o te waahi whakaahua, e kii ana he maha nga mema paremata i noho ki nga rohe rererangi i te kaha o te kaha o te papa autō.
Ko nga whakaahua o (a) i mua me te (b) i muri i te tuku MP5 ki roto i te pukoro o te kiore katahi ano ka whakakorehia me te aukume kua tuu ki runga ake i te waahi whakaahua.Ko te waahi e whakaatuhia ana kei waenganui i nga mowhiti cartilaginous e rua.He wai kei roto i nga huarahi rererangi i mua i te tukunga o te MP.Ko te pouaka whero e tohu ana i te whakanui e whakanui ana i te rereke.Ko enei whakaahua ka tangohia mai i te riipene whakaata i roto i te S6: Ataata Tāpiri MP5.
Ko te neke i te aukume i te taha o te trachea i roto i te vivo ka puta he huringa i te koki o te mekameka MP i runga i te mata o te rangi, he rite ki tera i kitea i roto i nga capillaries (tirohia te Whakaahua 8 me te Ataata Tāpiri S7: MP5).Heoi, i roto i ta maatau rangahau, kaore e taea te toia nga mema paremata i runga i te mata o nga ara manawa ora, ka taea e nga capillaries.I etahi wa, ka roa te mekameka MP ka neke te aukume ki te taha maui me te taha matau.He mea whakamiharo, i kitea ano e te mekameka matūriki te huri i te hohonutanga o te paparanga mata o te wai i te wa e nekehia ana te aukume i te taha o te pukoro, me te whakawhānui i te wa e neke tika ana te aukume ki runga ake ka huri te mekameka matūriki ki te tuunga poutū (tirohia Ataata Tāpiri S7).: MP5 i te 0:09, raro matau).I rereke te ahua o te ahua o te neke i te wa e nekehia ana te aukume ki te taha o runga o te pukoro (ara, ki te taha maui, ki te taha matau ranei o te kararehe, kaua ki te roa o te pukoro).I kitea tonu nga matūriki i te wa e nekehia ana, engari i te wa i tangohia ai te aukume i te pukoro, ka kitea nga pito o nga aho matūriki (tirohia te Ataata Tāpiri S8: MP5, timata i te 0:08).E whakaae ana tenei ki te whanonga i kitea o te papa autō i raro i te mahi a te papa autō i whakamahia i roto i te karaehe karaehe.
He tauira whakaahua e whakaatu ana i te MP5 i roto i te pukoro o te kiore kua ora.(a) Ka whakamahia te aukume ki te tiki whakaahua i runga ake me te taha maui o te pukoro, ka (b) i muri i te neke i te aukume ki te taha matau.Ko te pouaka whero e tohu ana i te whakanui e whakanui ana i te rereke.Ko enei whakaahua mai i te riipene whakaata i roto i te Ataata Tāpiri a S7: MP5.
I te wa i whakatangihia nga pou e rua ki te taha raki-te-tonga i runga ake, i raro hoki i te trachea (arā, te kukume; Fig. 3b), ka roa ake te ahua o nga taura MP, ka noho ki te pakitara taha o te trachea, kaua ki te mata o muri o te papa. trachea (tirohia te Apiti).Ataata S9:MP5).Heoi, karekau i kitea te nui o nga matūriki i te waahi kotahi (arā, ko te mata o muri o te trachea) i muri i te whakahaerenga wai ma te whakamahi i te taputapu aukume rua, ka puta me te taputapu aukume kotahi.Na, i te wa i whirihorahia ai tetahi aukume hei turaki i nga pou keehe (Whakaahua 3c), kaore i piki te maha o nga matūriki e kitea ana i te waahi tirohanga i muri i te tukunga.He uaua te whakarite i nga whirihoranga aukume e rua na te kaha o te kaha o te papa aukume e kukume ana, e pana ana ranei i nga aukume.Ka huri te tatūnga ki te aukume kotahi e whakarara ana ki nga huarahi rererangi engari ka haere i roto i nga huarahi rererangi i te koki 90 nga nekehanga kia whiti ai nga raina kaha ki te pakitara o te pukoro (Whakaahua 3d), he tikanga ki te whakatau i te tupono o te whakahiato matūriki ki runga. te pakitara taha.kia mau.Heoi, i roto i tenei whirihoranga, kaore he nekehanga whakaemi MF, he nekehanga aukume ranei.I runga i enei hua katoa, i whiriwhiria he whirihoranga me te aukume kotahi me te whakatakotoranga 30-tohu mo nga rangahau in vivo o nga kawe ira (Fig. 3a).
I te wa i whakaahuahia te kararehe i nga wa maha i muri tonu i tana patunga tangata, ko te kore o te whakakorikori i nga nekehanga o te kikokiko ka kitea he pai ake, he poto ake nga raina matūriki ka kitea i roto i te mara intercartilaginous marama, e 'wiri ana' i runga i te nekehanga o te whakamaoritanga o te aukume.kite marama te aroaro me te nekehanga o nga matūriki MP6.
Ko te titer o te LV-LacZ ko te 1.8 x 108 IU/mL, a, i muri i te whakaranu i te 1:1 me CombiMag MP (MP6), ka werohia nga kararehe ki te 50 µl o te horopeta tracheal o 9 x 107 IU/ml o te waka LV (ara 4.5 x 106 TU/kiore).)).I roto i enei rangahau, hei utu mo te neke i te aukume i te wa e mahi ana, ka whakatikahia e matou te aukume ki te waahi kotahi ki te whakatau mena ka taea e te whakawhiti LV (a) te whakapai ake ki te tuku vector i te kore o te papa aukume, me te (b) mena ka taea e te huarahi rererangi. kia arotahi.Ko nga pūtau e whakawhitihia ana i roto i nga waahi tohu autō o te waahanga manawa o runga.
Ko te noho mai o nga aukume me te whakamahi i te CombiMag i roto i te whakakotahitanga me nga vectors LV karekau i pa ki te hauora o nga kararehe, pera i ta maatau tikanga tuku LV vector paerewa.Ko nga whakaahua o mua o te rohe tracheal i raro i te raruraru miihini (Taupiri Pikitia 1) i whakaatu ko te roopu LV-MP i tukinotia he nui ake nga taumata whakawhiti i te aroaro o te aukume (Fig. 9a).He iti noa iho te tae puru LacZ i roto i te roopu whakahaere (Whakaahua 9b).Ko te inenga o nga rohe kua pokea-X-Gal i whakaatu ko te whakahaeretanga o te LV-MP i te aroaro o te papa aukume i hua tata ki te 6-whakapai ake (Fig. 9c).
He tauira o nga whakaahua hiato e whakaatu ana i te whakawhiti i te tracheal me te LV-MP (a) i te aroaro o te papa autō me te (b) i te kore o te aukume.(c) He tino pai ake te tatauranga i roto i te waahi kua whakaritea o LacZ whakawhiti i roto i te trachea me te whakamahi i te aukume (*p = 0.029, t-whakamatautau, n = 3 mo ia roopu, toharite ± hapa paerewa o te toharite).
Ko nga waahanga whakaheke-whero tere (te tauira e whakaatuhia ana i te Whakaaturanga Tāpiri 2) i tohu ko nga pūtau kua pokea-LacZ kei roto i te tauira kotahi me te waahi ano i korerotia i mua.
Ko te wero nui i roto i te whakamaarama ira ira rererangi ko te waahi tika o nga matūriki kawe i roto i nga waahi e aro nui ana me te whakatutukitanga o te taumata teitei o te kaha o te whakawhiti i roto i te pukahukahu pūkoro i te aroaro o te rere o te hau me te whakakoi i te mucus kaha.Mo nga kaikawe LV e whakaarohia ana mo te maimoatanga o nga mate manawa i roto i te cystic fibrosis, ko te whakanui ake i te wa noho o nga matūriki kaikawe i roto i nga huarahi rererangi, he kaupapa kore e taea.I tohuhia e Castellani et al., ko te whakamahinga o nga papa autō ki te whakarei ake i te whakawhitinga he painga ki etahi atu tikanga tuku ira penei i te electroporation na te mea ka taea te whakakotahi i te ngawari, te ohanga, te tuku rohe, te pikinga o te kaha, me te wa poto o te incubation.me te iti rawa o te horopeta o te waka10.Heoi ano, ko te nohonga o roto i vivo me te whanonga o nga matūriki autō i roto i nga huarahi rererangi i raro i te awe o nga mana autō o waho kaore ano kia whakaahuahia, me te mea ko te kaha o tenei tikanga ki te whakanui ake i nga taumata whakaputa ira i roto i nga huarahi rererangi ora tonu kaore ano i whakaatuhia i roto i te vivo.
Ko o maatau whakamatautau in vitro i runga i te PCXI synchrotron i whakaatu ko nga matūriki katoa i whakamatauria e matou, haunga te polystyrene MP, i kitea i roto i te tatūnga whakaahua i whakamahia e matou.I te aroaro o te papa aukume, ka hanga aho nga papa autō, ko te roa e pa ana ki te momo matūriki me te kaha o te papa aukume (arā, te tata me te neke o te aukume).E whakaatu ana i te Whakaahua 10, ko nga aho e kitea ana ka hangai i te mea ka aukumetia ia matūriki me te whakaawe i tana ake papa autō.Ko enei mara motuhake ka kohia etahi atu matūriki rite ki te hono ki nga nekehanga aho o te roopu na te kaha o te rohe mai i nga kaha o te kukume me te whakakore i etahi atu matūriki.
Hoahoa e whakaatu ana (a, b) nga mekameka matūriki e hanga ana i roto i nga kapia kapi-wai me te (c, d) he pukoro kua whakakiia ki te hau.Kia mahara ko nga capillaries me te trachea kaore e kumea ki te tauine.Kei te Paepae (a) he whakaahuatanga mo te MF kei roto nga matūriki Fe3O4 kua whakaritea ki nga mekameka.
I te nekenga o te aukume ki runga i te kapi, ka tae te koki o te aho matūriki ki te paepae tino nui mo te MP3-5 kei roto Fe3O4, i muri iho ka kore te aho matūriki i noho ki tona turanga taketake, engari ka neke haere i te mata ki te waahi hou.aukume.Ka puta pea tenei paanga na te mea he maeneene te mata o te karaehe karaihe kia taea ai tenei nekehanga.Ko te mea whakamere, kare a MP6 (CombiMag) i penei te ahua, na te mea he iti ake nga matūriki, he rereke te paninga, he utu mata ranei, i pa ranei te wai kawe kawe i to raatau kaha ki te neke.He ngoikore ano te rereke o te ahua matūriki CombiMag, e kii ana he rite tonu te kiato o te wai me nga matūriki, no reira kaore e taea te neke ngawari ki a raatau.Ka taea hoki te mau matūriki ki te tere rawa te neke o te aukume, e tohu ana kaore e taea e te kaha o te papa aukume te wikitoria i nga wa katoa te waku i waenga i nga matūriki i roto i te wai, e kii ana ko te kaha o te papa aukume me te tawhiti i waenga i te aukume me te waahi whaainga kia kaua e tae mai hei a ohorere.nui.E tohu ana hoki enei hua ahakoa ka taea e nga aukume te hopu nga matūriki moroiti e rere ana i roto i te waahi kua tohua, kare pea e taea te whakawhirinaki ki nga aukume ki te neke matūriki CombiMag i te mata o te trachea.No reira, i whakatauhia e maatau i roto i nga rangahau vivo LV MF me whakamahi nga papa autō pateko ki te aro tinana ki nga waahi motuhake o te rakau rererangi.
Kia tukuna nga matūriki ki roto i te tinana, he uaua ki te tautuhi i roto i te horopaki o te kiko nekeneke o te tinana, engari kua pai ake te kaha ki te kite ma te neke whakapae i te aukume ki runga i te trachea ki te "wiriwiri" nga aho MP.Ahakoa ka taea te atahanga i te waa, he maamaa ake te kite i nga nekehanga matūriki i muri i te whakamatenga tangata.I te nuinga o te wa ko te nuinga o nga kuhanga MP i tenei waahi i te wa i tuuhia ai te aukume ki runga ake i te waahi atahanga, ahakoa ko etahi matūriki ka kitea ki raro i te pukoro.Kaore i rite ki nga rangahau in vitro, kaore e taea te toia nga matūriki ki raro i te trachea ma te neke o te aukume.He rite tonu tenei kitenga ki te mahi a te hūpē e kapi ana i te mata o te trachea i nga matūriki kua whakangoatia, ka mau ki roto i te hūpē, ā, ka whakawātea mā te tikanga whakawātea muco-ciliary.
I whakapae matou ko te whakamahi aukume i runga ake, i raro hoki i te trachea mo te kukume (Fig. 3b) ka hua ake te ahua o te papa aukume, kaua ki te papa aukume e tino aro ana ki te waahi kotahi, ka hua ake pea te tohatoha o nga matūriki..Heoi, karekau i kitea e ta maatau rangahau tuatahi nga taunakitanga hei tautoko i tenei whakapae.Waihoki, ko te whakatau i nga aukume takirua ki te whakakore (Fig. 3c) kaore i nui ake te taunga matūriki ki te waahi whakaahua.Ko enei kitenga e rua e whakaatu ana ko te tatūnga aukume-rua kare e tino whakapai ake i te mana o te rohe o te tohu MP, a he uaua nga mahi autō ka puta, ka iti ake te mahi o tenei huarahi.Waihoki, ko te whakatakotoranga i te aukume ki runga ake, puta noa i te trachea (Whakaahua 3d) kaore ano i nui ake te maha o nga matūriki e toe ana ki te waahi whakaahua.Ko etahi o enei whirihoranga rereke kare pea e angitu i te mea ka heke te kaha o te papa autō i roto i te rohe tuku.No reira, ko te whirihoranga aukume kotahi i te 30 nga nekehanga (Fig. 3a) e kiia ana ko te tikanga whakamatautau i roto i te vivo tino ngawari me te tino pai.
I whakaatuhia e te rangahau LV-MP i te wa i honoa ai nga vectors LV ki a CombiMag ka tukuna mai i muri i te whakararuraru a tinana i te aroaro o te papa autō, ka tino piki ake nga taumata whakawhiti i roto i te trachea i whakaritea ki nga mana whakahaere.I runga i nga rangahau whakaahua synchrotron me nga hua o te LacZ, ko te ahua o te papa autō ka taea te pupuri i te LV i roto i te trachea me te whakaiti i te maha o nga matūriki vector ka uru tonu ki roto i te puku.Ka taea e enei whakapainga ki te piki ake te pai i te wa e whakahekehia ana nga tohu kua tukuna, te whakawhitinga kore-whakaaro, te mumura me te mate aukati, me nga utu whakawhiti ira.Ko te mea nui, e ai ki te kaihanga, ka taea te whakamahi a CombiMag me etahi atu tikanga whakawhiti ira, tae atu ki etahi atu vectors viral (penei i te AAV) me nga waikawa nucleic.