Ko te Giardia duodenum he rauropi pirinoa e puta ai te giardiasis, he mate whekau e tino kitea ana i nga tamariki nohinohi me nga tohu haumanu o te mate korere.Kua korerohia e matou i mua ko te extracellular G. duodenalis te whakaoho i te whakaurunga o te oligomerization-like receptor 3 (NLRP3) e herea ana i nga nucleotides me te whakahaere i nga urupare inflammatory a te kaihautu na roto i te hunanga extracellular vesicle (EV).Heoi ano, ko nga tauira irapoi tika o te pathogen-associated duodenococcal EV (GEV) i uru ki tenei mahi me te mahi a te NLRP3 inflammasome i roto i te giardiasis ka noho tonu ki te whakamarama.
I hangaia nga plasmids eukaryotic recombinant pcDNA3.1(+)-alpha-2 me alpha-7.3 giardins i GEV, ka whakawhitia ki roto ki nga macrophages peritoneal tuatahi kiore, ka kitea ma te ine i te muingo ngota ngota caspase-1.I tirotirohia te taumata whakapuaki p20..Ko te G. duodenalis alpha-2 me te alpha-7.3 giardines i tautuhia i te tuatahi ma te ine i te NLRP3 inflammasome (NLRP3, pro-interleukin-1 beta [IL-1β], pro-caspase-1 me caspase-1 p20), IL secretion.1β taumata, apoptotic spotted protein (ASC) oligomerization taumata, me te immunofluorescent localization o NLRP3 me ASC.Ko te mahi a te NLRP3 inflammasome i roto i te pathogenicity o G. duodenalis ka aromatawaihia ma te whakamahi i nga kiore i aukatihia ai te whakahohenga NLRP3 (NLRP3 kua aukatihia nga kiore) me nga huringa pathological i te taimaha o te tinana, te kawenga parasitic duodenal, me te kiko duodenal i aroturukihia.I tua atu, i tirotirohia e matou mehemea ko te hiardines alpha-2 me alpha-7.3 te whakauru i te IL-1β secretion i roto i te vivo ma te NLRP3 inflammasome me te whakatau i te mahi o enei ngota i roto i te pathogenicity o G. duodenalis i roto i nga kiore.
Ko te Alpha-2 me te alpha-7.3 giardines e akiaki ana i te whakahohe o te NLRP3 inflammasome in vitro.Na tenei i arahina ki te whakahohe i te p20 caspase-1, te piki ake o nga taumata korero o te NLRP3, te pro-IL-1β, me te pro-caspase-1 pūmua, he nui te piki o te IL-1β secretion, te hanganga o nga waahi ASA i roto i te cytoplasm, me te whakaurunga o te ASA oligomerization.Ko te mumura o te NLRP3 ka nui ake te mate o te penile i te pathogenicity o G. duodenalis i roto i nga kiore.Ko nga kiore i tukinotia ki te kiore ma te tangohanga mai i nga kiore kua aukatihia e te NLRP3 kua piki ake te maha o nga trophozoites me te kino kino ki te pukoro duodenal, e tohuhia ana e nga crypts necrotic kua mimiti me te manga.I roto i nga whakamatautau vivo kua whakaatuhia ko nga giardine alpha-2 me alpha-7.3 ka taea te whakauru i te IL-1β ma te NLRP3 inflammasome, me te kano kano ki te giardines alpha-2 me te alpha-7.3 i whakaiti i te pathogenicity o G. duodenalis i roto i nga kiore.
Ko nga hua o tenei rangahau e kii ana ko te giardia alpha-2 me te alpha-7.3 te take i te whakatikatika i te mumura o te kaihautu NLRP3 me te whakaiti i te mate o te G. duodenalis i roto i nga kiore, he kaupapa whai hua hei aukati i te giardiasis.
Ko te Giardia duodenum he parapara protozoan extracellular e noho ana i roto i te whekau iti me te 280 miriona nga keehi o te giardiasis me te korere i ia tau, ina koa i waenga i nga tamariki nohinohi i nga whenua whakawhanake.Ka pangia te tangata i te inu wai, i te kai ranei kua pokea e te M. duodenum cysts, ka uru ki roto ki te puku ka puta ki roto i nga wai pekiti.Ko te Giardia duodenum trophozoites e piri ana ki te epithelium duodenal, ka puta te nausea, te ruaki, te mate pukupuku, te mamae o te puku, me te mate taimaha.Ko nga tangata e mate ana i te mate mate me te cystic fibrosis ka pangia e te mate.Ka puta ano te mate ma te waha waha me te whakaeneene [2].Ko nga raau taero penei i te metronidazole, tinidazole, me te nitazoxanide nga momo maimoatanga pai mo nga mate duodenal [3].Heoi, ko enei raau taero chemotherapy ka puta nga paanga kino penei i te nausea, carcinogenesis, me te genotoxicity [4].Na reira, me whakawhanake ake nga rautaki whai hua hei aukati i te mate G. duodenalis.
Ko te Inflammasomes he karaehe o nga matatini pūmua cytosolic he waahanga o te urupare mate mate, e awhina ana ki te tiaki i te whakaekenga pathogen me te takawaenga i nga urupare mumura [5].I roto i enei inflammasomes, ko te oligomerization (NOD) te kaiawhina nucleotide-binding oligomerization (NOD) receptor 3 (NLRP3) nucleotide-binding oligomerization (NLRP3) nucleotide-binding-like inflammasome kua tino rangahaua na te mea ka kitea e nga momo momo pathogen/mate-mate-a-te-a-mate (PAMP) DAMP), ka mohio, ka whakahohe i te punaha mate mate.me te whakahaere i te homeostasis intestinal i roto i te maha o nga mate inflammatory [6,7,8].Kei roto ko te kaiwhakawhiwhi tohu tohu (PRR) NLRP3, he pūmua kotingotingo apoptotic (ASC), me te procaspase-1, procaspase-11 ranei.Ko te NLRP3 inflammasome te mahi hei kaihautu ki te whakaekenga o te pathogen, pera i kitea i roto i te Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10], me nga rangahau Leishmania.[11], engari kua panuitia ano ko te whakahohenga o te NLRP3 inflammasome ka whakawhäiti i nga urupare aukati whakamarumaru me te whakanui ake i te ahunga whakamua o te mate, hei tauira, i roto i nga kutukutu [12].I runga i o maatau kitenga o mua, i kii matou ko te extracellular G. duodenalis e whakaohooho ana i te whakaurunga intracellular o te mumura NLRP3 me te whakarereke i nga urupare inflammatory a te ope ma te huna i nga vesicles extracellular (EVs) [13].Engari, ko te mahi a te NLRP3 inflammasome i roto i te mate G. duodenalis i roto i te vivo ka noho tonu ki te whakatau.
Ko nga Giardins i whakaahuahia i te tuatahi ko nga waahanga hanganga o te G. duodenalis cytoskeleton me te whai waahi nui ki te motireti trophozoite me te taapiri pūtau epithelial i roto i te kohanga iti.Kia pai ake ai te urutau ki te taiao me te whakanui ake i to ratau pathogenicity, i whakawhanakehia e G. duodenalis trophozoites he hanganga cytoskeletal ahurei ko te 8 flagella, 1 te tinana waenganui, me te 1 ventral disc [14].Ko nga trophozoites o Giardia duodenum e whakamahi ana i o raatau cytoskeleton ki te kuhu ki te kohanga iti o runga, ina koa te duodenum, ka piri ki nga enterocytes.Heke tonu, ka piri ki nga pūtau epithelial ma te whakamahi i te metabolism pūtau.Na reira, he hononga tata i waenga i o raatau cytoskeleton me te kino.Ko nga Giardines motuhake mo Giardia duodenum he waahanga o te hanganga cytoskeleton [15] ka wehewehea ki nga akomanga e wha: α-, β-, γ-, me δ-giardines.E 21 nga mema o te whanau α-giardin, kei a raatau katoa te kaha o te konupūmā ki te here i nga phospholipids [16].Ka hono ano hoki ratou i te cytoskeleton ki te membrane pūtau.I roto i nga tangata takitahi me te mate pukupuku na te G. duodenalis, ka tino whakaatuhia te α-giardins me te immunoreactive i te wa o te mate [17].Ko nga kano kano heterologous i runga i te Giardia alfa-1 ka tiakina mai i te giardiasis i roto i nga kiore, he antigens kaitono mo te whanaketanga kano kano [18].Ko te Alpha-8 giardin, kei te waahi i roto i te membrane plasma me te flagella, engari kaore i roto i te kōpae ventral, ka whakanui ake i te moti me te tipu o te trophozoites i G. duodenalis [19].Ko te Alpha-14 giardin e piri ana ki nga hanganga microtubule i runga i te haki, ka pa ki te oranga o G. duodenalis [20].He nui te Alpha-11 giardine puta noa i te huringa o te ora, a ko te nui o te korero o te alpha-11 giardine ka pakaru a G. duodenalis ake [21].Heoi, kaore i te maarama mena he whakamarumaru te alpha-2 giardine me te alpha-7.3 giardine ki te mate G. duodenalis me o raatau tikanga.
I roto i tenei rangahau, ko nga plasmids eukaryotic expression recombinant pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine me te pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine i whakawhitia ki roto ki nga macrophages peritoneal tuatahi kiore ki te whakahohe i te ope NLRP3.Katahi ka tirotirohia nga whaainga mumura.I aromatawaihia ano hoki e matou te mahi a te NLRP3 inflammasome i roto i te pathogenicity o G. duodenalis, i tirotirohia mena he alpha-2 me alpha-7,3 giardines te whakauru i te whakahohe o te NLRP3 inflammasome i roto i te vivo, me te whakatau ko enei mahi e rua o nga giardines i roto i te pathogenicity o G. duodenalis.Ko ta matou whainga noa ko te whakawhanake i nga whaainga pai mo te aukati i te mate G. duodenalis.
Ko te momo mohoao (WT) C57BL/6 kiore wahine 5-8 wiki i hokona mai i Liaoning Changsheng Experimental Animal Center (Liaoning, Haina).Ko nga kiore he watea ki te wai, ka whiwhi kai kua whakahoroa, ka puritia i roto i te 12/12 haora marama/pouri.I mua i te mate, ka whiwhi nga kiore i nga patu paturopi ad libitum i roto i te wai inu kua taapirihia ki te ampicillin (1 mg / mL), vancomycin (1 mg / mL), me te neomycin (1.4 mg / mL) (i hokona katoa mai i Shanghai, Haina, nga rauropi waihanga) [22 ].].Ko nga kiore kua ngaro te kaha ki te kai me te inu mo te> 24 haora ka ngaro ≥ 20% te taumaha o te tinana i whakakorehia e te tangata na te wehenga o te kopu.
WB G. duodenalis trophozoites (American Type Culture Collection, Manassas, USA) i tapirihia ki te 12.5% ​​​​serum bovine fetal (FBS; Nga Kaakaariki katoa, Zhejiang, Haina) me te 0.1% bovine bile (Sigma-Aldrich, St. Missouri, USA ).USA) i raro i nga tikanga microaerobic.I kohia nga trophozoites i runga i te hukapapa ka paahihia ki te 1:4 mo te whakaputa uri ano.
Ko te Giardia duodenum cysts i whakaawehia kia rite ki te korero i mua [23], ka hauhakehia nga trophozoites i roto i te wahanga logarithmic katahi ka diluted ki te reo whakauru whakauru, pH 7.1 (TYI-S-33 kua whakarerekehia) ki te kukū whakamutunga o te 1 × 106 trophozoites / mL.0.05% te kukū o te ate.I whakatipuhia nga Trophozoites i raro i nga tikanga anaerobic i te 37°C tae noa ki te wahanga tipu taukohiko.Hurihia te reo ki te reo whakaihiihi (pH 7.8; kua whakarereketia te reo TYI-S-33 me te 1% te kukū o te bile) me te ahurea G. duodenalis i te 37°C mo te 48-96 haora, i te wa i kitea ai nga kirikiri hanga i raro i te karu.I muri i te whakaawenga o te nuinga o nga trophozoites ki te hanga i te kirikiri, ka hauhaketia te ranunga ahurea ka whakairihia ki roto i te wai deionized parakore hei lyse i nga toenga trophozoites.Ka tatauhia nga kirikiri me te rongoa ki te 4°C mo nga tātaritanga o muri mai i roto i te ngongo puku o te kiore.
Giardia extracellular vesicles (GEVs) i whakarangatirahia i runga i te korero o mua [13].Ko nga Trophozoites i roto i te wahanga tipu taukohiko i whakatarewahia i roto i te reo TYI-S-33 kua whakarereketia me te FBS kua whakahekehia (Biological Industries, Beit-Haemek, Israel) ki te kukū whakamutunga o te 1 × 106 pirinoa/mL, ka whakakororia mo te 12 haora.i wehea mai i te supernatant ahurea ma te centrifugation i te 2000 g mo te 10 min, 10,000 g mo te 45 min, me te 100,000 g mo te 60 min.I rewa nga rerenga i roto i te phosphate buffered saline (PBS), i ine ma te whakamahi i te kete BCA protein assay kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ka rongoa ki te -80° C. ka whakamahia tika ranei mo etahi atu tātaritanga.
I whakaritea nga macrophages peritoneal kiore tuatahi i whakaahuahia i mua [24].I te wa poto, ko nga kiore (6-8 wiki te pakeke) i werohia (intraperitoneally [ip]) me te 2.5 ml o te 2.98% Difco liquid thioglycol medium (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) me te whangai i nga papa 3-4.He whakatārewatanga o macrophages i kohia mai i te kohanga puku o nga kiore i muri i te euthanasia me te centrifuged 3 wa i te 1000 g mo te 10 min.Ko nga pūtau hauhake i kitea e te rere cytometry ma te whakamahi i te tohu CD11b tae noa ki te 98% te purenga o nga pūtau, katahi ka tapirihia ki nga papaa ahurea pūtau 6-puna (4.5 x 106 pūtau/poka) ka whakakororia ki te 10% FBS (Bioindustrie) i te 37°C.me te 5% CO2.
I tangohia te RNA mai i te 1 × 107 trophozoites i roto i te 1 ml o te TRIzol reagent (Vazyme, Nanjing, Haina), i tangohia te DNA genomic mai i te G. duodenalis RNA katoa ma te whakamahi i te MonScript dsDNase (Monad, Wuhan, Haina) me te DNA taapiri (cDNA) i whakahiatohia. te whakamahi i te MonScript RTIIII Super Mix (Monad) kia rite ki nga tohutohu a te kaihanga.
Ko nga korero raupapa CDS mo te ira G. duodenalis i whiwhi mai i te NCBI GenBank.Whakamahia te Primer 5.0 ki te hoahoa i nga tohu tuatahi mo te kati mo ia ira.Ko te tuatahi o mua (5'-3') e toru nga wahanga: he raupapa inaki me te vector pcDNA3.1(+) Rarangirangi EcoRV (TGGTGGAATTTCTGCAGAT) ka tiimata nga codons ATG me te GNN (mehemea ehara ko te G te turanga tuatahi).Ka mahia tenei hei whakapai ake i te pai o te korero.I tua atu, i te iti rawa 16 bp turanga whakakotahi (GC ihirangi 40–60%/Tm āhua 55 °C).Ko te tuatahi whakamuri (5′-3′) e rua nga wahanga, he raupapa inaki me te EcoRV-linearized vector pcDNA3.1(+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) me te turanga whakakotahi o te iti rawa 16 bp.(haunga nga waahi whakamutunga e rua).nga turanga) he codon penei i te AA, i te GA ranei hei tuku i nga plasmids recombinant ki te whakaatu i o raatau tohu tohu).Kua whakarārangihia ngā raupapa tuatahi ki te Ripanga 1, ā, i whakahiatotia e Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Changchun, Haina).
I whakanuia nga whaainga ma te whakamahi i te Pfu DNA polymerase (Tiangen, Beijing, Haina) ranei Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Beijing, Haina) ma te whakamahi G. duodenalis cDNA hei tauira.Ko te whakaaturanga eukaryotic vector plasmid pcDNA3.1(+) i whakarārangitia ki te whākōkī aukati EcoRV me te dephosphorylated mā te whakamahi i te Fast AP (Thermo Fisher Scientific).Ko nga kongakonga pcDNA3.1(+) kua whakahiatohia me nga kongakonga ira whainga kua whakakahahia i purea ma te whakamahi i te kete purenga kiri DNA (Tiangen) me te ine ma te Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific).Ko te kongakonga pcDNA3.1(+) me ia wahanga ira whainga i whakakotahihia ma te whakamahi i te whakakotahitanga o te whakakotahitanga o te hui kotahi a MonClone (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, Haina) me te whakapumauhia e te raupapa DNA ma te whakamahi i te Comate Bioscience Company Limited (Changchun, Haina) ..
Ko nga plasmids kore-endotoxin pcDNA3.1(+)-alpha-2 me te pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 i hangaia ma te whakamahi i te SanPrep Endotoxin-free Plasmid Mini Kit (Sangon Biotech).I mau tonu te kukū ki runga ake i te 500 ng/µl ki te whakarite kia kore te EDTA i roto i te parepare elution e pokanoa ki te whakamatautau whakawhiti.Ko nga macrophages peritoneal kiore tuatahi i whakatipuhia i roto i nga pereti 6-poka me te reo RPMI 1640 oti (Biological Industries) mo nga haora 12, katahi ka horoia nga ruma e toru nga wa i roto i te PBS mahana hei tango i te penicillin me te streptomycin, katahi ka whakakiia ki te reo kua oti.Ko nga plasmids Endotoxin-free pcDNA3.1(+)-alpha-2 me te pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (2.5 μg) i diluted i roto i te 125 μl o te Opti-MEM iti te reo serum (Gibco, Thermo Fisher Scientific)..Katahi te 5 µl o te Lipofectamine 2000 reagent whakawhiti (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) i waimeha ki roto i te 125 µl o te reo Opti-MEM serum iti.Whakapaia nga matatini liposome-DNA ma te whakaranu i te plasmid kore-endotoxin kua waimeha ki te Lipofectamine 2000 me te tuku i te ranunga kia tu ki te pāmahana rūma mo te 5 meneti.Whakawhiti wehea nga matatini ki nga ruma o ia puna ka uru ata.I muri i nga haora 4, ka whakakapihia te reo ahurea pūtau ki te 2 ml o te reo RPMI 1640 oti, ka haere tonu te ahurea mo te 24 haora.I taapirihia te reo ahurea pūtau hou ki nga pūtau, ka whakawhaohia mo nga wa rereke i runga i te hoahoa whakamatautau.
Ko nga tauira pūmua mai i nga supernatants me nga lysates pūtau i rite i whakaahuahia i mua [25].Ko nga tawhā whakawhiti membrane mo te pro-IL-1β, pro-caspase-1, caspase-1 p20, NLRP3, β-actin, me tana tohu he 200 mA / 90 min.Mo te interleukin 1β (IL-1β; R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA), caspase-1 (p20) (Adipogen, Switzerland) me NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Switzerland) me te 1: 5000 e aro ana ki tana tohu (Amylet Scientific, Wuhan, Haina) me te β-actin (Proteintech, Wuhan, Haina).
Ko te hononga-whakawhitinga me te succinimide suberate (DSS) i mahia pera i korerohia i mua [26].I horoia nga pūtau e 3 nga wa ki te PBS matao, ka rea ​​katoatia ki te ngira mehua 27 i roto i te 50 µl ASC tauhohenga buffer (pH 8.0) kei roto 25 mM Na2PO4, 187.5 mM NaCl, 25 mM HEPES me 125 mM NaHCO3.Ko te ranunga i centrifuged i te 5000 g mo te 3 min, ka tuia te pire ki te 10 µl DSS (25 mM i DMSO) me te 40 µl ASC tauhohenga buffer mo te 30 min i te 37°C.I muri i te centrifugation i te 5000 g mo te 10 min, ka rewa te pire i roto i te otinga o te 40 µl o te ASC tauhohenga buffer me te 10 µl o te 6x pūmua uta buffer (TransGen, Beijing, Haina), ka tineia te otinga i te pāmahana rūma mo te 15 min., Na ka kohuatia mo te 10 meneti.Ko nga tauira pūmua ka tukuna ki te whakakore i te Hauauru ma te whakamahi i nga paturopi anti-ASC tuatahi (Wanleibio, Shenyang, Haina) i te tauwehenga waimeha o te 1:500.
I muri i te tukanga i whakaahuahia i mua [13], ka kohia nga supernatants ahurea pūtau me te hunanga o te cytokine pro-inflammatory IL-1β i whakatauhia ma te whakamahi i te kiore IL-1 Beta ELISA kete (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).Hurihia nga uara OD450nm ki nga kohinga pūmua ma te whakamahi i te pihi paerewa IL-1β.
Ko nga pūtau kua pania ki runga i nga uhi hipoki ka ata horoia kia 3 nga wa i roto i te PBS mahana, ka mau ki roto i te whakakikorua pūtau kiko (Biosharp, Beijing, Haina) mo te 10 min i te pāmahana rūma (RT), i roto i te 0.1% Triton X-Permeabilize i te 100 (kua diluted i te PBS; Biosharp ) mo te 20 meneti i te pāmahana rūma me te poraka i roto i te 5% bovine serum albumin (i roto i te PBS) mo te 2 haora i te pāmahana rūma.Ka whakakorohia nga pūtau i te po i te 4°C me nga paturopi tuatahi ki te ASC (1:100 dilution) me te NLRP3 (1:100 dilution), me te Cy3 kua tapaina he koati anti-rabbit IgG(H+L) (1:400; EarthOx , San Francisco, CA, USA) ranei FITC-conjugated goat anti-mouse IgG (1:400; Earthox) i te po i te 37°C i roto i te pouri mo te 1 haora.I pania nga karihi ki te Hoechst 33258 (10 μg/ml; UE, Suzhou, Haina) mo te 5 meneti ka matakihia i raro i te microscope fluorescence (Olympus Corporation, Tokyo, Japan).
I wehea nga kiore kia wha nga roopu (n = 7 i ia roopu): (i) PBS-trea negative group control (PBS only; gavage 100 µl/kiore PBS whai muri i te werohanga intraperitoneal ia ra 100 µl/kiore PBS 3 haora i muri mai)., haere tonu mo nga ra 7);(ii) te roopu whakahaere kino i tukinotia ki te aukati MCC950 [27] (100 µl/kiore na roto i te PBS gavage, 3 haora i muri mai, 10 mg/kg te taumaha tinana [BW] MCC950 [i te PBS] i whakahaerehia i roto i nga ra katoa, te roanga 7 ra);(iii) G. duodenalis cyst group infection (1.5 x 106 cysts/kiore by gavage, 3 hours later, 100 μl/mouse PBS intraperitoneally administered daily for 7 days);(iv) G. duodenalis cyst te whakakotahi i te roopu mate MCC950 te roopu maimoatanga aukati (1.5×106 cysts/kiore ma te gavage, 10mg/kg te taumaha tinana MCC950 intraperitoneally ia ra mo te 7 ra i te 3h).Ko te taumaha o te tinana o ia kiore i aro turukihia i ia ra, i te 7 o nga ra ka whakakorehia nga kiore katoa.Ko te duodenum kua hauhaketia (3 cm te roa) ka tapahia ki nga wahi iti i roto i te 1 ml PBS, ka pakaru nga cysts i te po i roto i te PBS i te 4 ° C, me te G. duodenalis trophozoites.Ko te duodenum hou (1 cm te roa) i wehea mo te hematoxylin me te eosin (H&E).
I wehewehea nga kiore ki nga roopu e rua: (i) te roopu whakahaere MOCK me (ii) te roopu aukati MCC950.E rima nga maimoatanga i ia roopu (n = 7 / roopu maimoatanga): (i) PBS maimoatanga kino te roopu whakahaere kino (PBS anake; 100 µl / kiore PBS, intramuscular (IM) werohanga (tibialis anterior) [28, 29];( ii) pcDNA3.1(+) plasmid rōpū whakahaere kino (100 µg/kiore DNA, mā te werohanga intramuscular) (iii) G. duodenalis cyst infection rōpū whakahaere pai (1.5 x 106 cysts/kiore, mā te gavage) (iv) a te roopu i tukinotia ki te plasmid pcDNA3.1(+)-alpha-2 (100 μg/kiore DNA, na roto i te werohanga intramuscular), me (v) he roopu i rongoatia ki te plasmid pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (100 μg/kiore Ko te DNA, i muri i nga haora 12 o te haere, ka whiwhi nga kiore i roto i te roopu aukati MCC950 i te werohanga intraperitoneal i ia ra o te MCC950 (10 mg / kg te taimaha o te tinana) mo nga ra 7, ko nga kiore i roto i te roopu MOCK i whiwhi i te rahinga rite o te maimoatanga PBS. Ko nga tauira toto he i kohia mai i nga kiore karu ka waiho i te po i te 4 °C ka wehea nga tauira Serum ma te whakamahi i te whakamaarama immunosorbent e hono ana i te enzyme (ELISA) me nga inenga o nga taumata IL-1β.
E toru tekau ma rima nga kiore i wehea kia rima nga roopu (n=7/rōpū).Ko te Rōpū 1 he roopu whakahaere kino i tukinotia ki te PBS: i whiwhi nga kiore i te 100 μl o te PBS i roto i te tinana me nga ra e 3 i muri mai na roto i te gavage.Ko te roopu 2 ​​he roopu whakahaere pai kua pangia e te G. duodenalis cysts: i werohia nga kiore ki te 100 μl o te PBS, me nga ra 3 i muri mai ka werohia te 1.5 x 106 kiore / kiore i roto i te kopu.Ko te roopu tuatoru - te kano kano plasmid me te pcDNA3.1(+) me te roopu whakahaere mo te mate pukupuku duodenal: i whiwhi kiore te 100 μg o te DNA plasmid pcDNA3.1(+)(im) i te waha, 1.5×106 cysts/kiore 3 mo te maha nga ra.Ko nga roopu 4 me te 5 he recombinant pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine plasmid or pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine plasmid i te taha o te G. duodenalis cyst infection.Rōpū whakamātautau: i whiwhi kiore te 100 µg o te pcDNA3.1(+)-giardine plasmid DNA (im), ka 3 ra i muri mai, 1.5 × 106 cysts/kiore i werohia ma te gavage.Ko te taimaha o te tinana o ia kiore i aroturukihia i muri i te whakaurunga o te G. duodenalis cyst i roto i te ngongo.I kohia te duodenum hou mo te inenga kawenga parapara me te tātari whakakanohi HE.
I tātarihia nga huringa histopathological i runga i te tikanga kua whakaputaina i mua [30].Ko te duodenum hou i whakakikoruatia ki te whakatika i nga pūtau kiko, ka mau ki te paraffin, ka tapahia ki nga waahanga 4 μm, ka pania ki te H&E ka tātarihia i raro i te karuiti marama.Ko nga huringa pathological tohu i roto i nga waahanga kiko e whitu mai i nga kiore motuhake e whitu i aromatawaihia e te tohunga mate kaore i te mohio ki te maimoatanga, ka mau ki te 200x whakanui.Ko te roa o te villi me te hohonu o nga crypts i whanganga i runga i nga tikanga kua whakaahuahia i mua.
Ko nga hua i roto i te vitro me te in vivo i whiwhi i roto i te toru.I hangaia nga kauwhata ma te whakamahi i te GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA).Ko nga rereketanga i waenga i nga roopu e rua i tātarihia e te whakamatautau-t, i te mea ko nga rereketanga i waenga i nga roopu ≥3 i tātarihia e te tātari kotahi-ara o te rereketanga (ANOVA) ma te whakamahi i te rorohiko SPSS (putanga 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, USA).I tātarihia nga raraunga mo te riterite o te rereketanga ma te whakamahi i te whakamatautau a Levene i muri mai i te whakamatautau post hoc a Bonferroni (B).Ko te hiranga e whakaatuhia ana ko te P<0.05, P<0.01, me te P<0.001 (kaore i te nui [ns]) (P>0.05).
Ko ta maatau tātaritanga o mua o nga proteomics GEV i roto i te Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) i whakaatu he maha nga whaainga ka uru ki te whakahohe i nga huarahi tohu inflammatory [13].I whiriwhiria e matou e rua nga whaainga whaihua, alpha-2 me alpha-7.3 giardins, whakakaha ake i enei ngota ka whakamahia hei hanga i te pcDNA3.1(+) eukaryotic expression vector.I muri i te raupapa, ka whakawhitia te recombinant pcDNA3.1(+)-alpha-2 me alpha-7.3 giardine expression plasmids ki roto i nga macrophages peritoneal kiore tuatahi, a ka kitea te pūmua waitohu caspase-1 p20 o te mumura (he wahanga o te caspase-1 kua whakahohehia) hei whakamaarama i nga ngota ngota matua ka puta te mumura.I kitea e nga hua ka taea e te alpha-2 me te alpha-7.3 giardines te whakaputa korero p20 caspase-1 rite ki te GEV.Kaore i kitea he paanga ki te whakahohenga caspase-1 i roto i te mana kino kaore i tukuna (PBS anake) me te mana plasmid pcDNA3.1 (+) (Whakaahua 1).
Inenga o p20 caspase-1 whakahohenga e pcDNA3.1(+)-alpha-2 me alpha-7.3 giardins.Ko te recombinant eukaryotic expression plasmids pcDNA3.1(+)-alpha-2 me alpha-7.3 giardines (i runga ake i ia ara) i whakawhitia ki roto i nga macrophages peritoneal kiore tuatahi me nga supernatants ahurea i hauhake i te 24 haora i muri mai.I whakamahia te whakakore i te Hauauru ki te ine i nga taumata korero o te waitohu caspase-1 p20 inflammasome pūmua.Ko te roopu maimoatanga PBS-anake (raina C) me te roopu pcDNA3.1 (+) monotherapy (pcDNA3.1 ara) i whakamahia hei mana kino, a ko te roopu maimoatanga GEV i whakamahia hei mana pai.Ko te whakaaturanga o te pūmua recombinant i whakapumauhia ma te kite i te tohu histidine i ia pūmua, a ko nga roopu pūmua e tumanakohia ana ko te alpha-2 giardine (38.2 kDa) me te alpha-7.3 giardine (37.2 kDa).GEV, Giardia duodenum vesicles extracellular, pcDNA3.1(+), EcoRV-linearized vector, SUP, supernatant
Ki te whakatau mena he alpha-2 giardine me te alpha-7.3 giardine te whakaputa i te whakaaturanga p20 caspase-1 me te whai waahi ki te whakahohe i te urupare inflammatory NLRP3 ope, pcDNA3.1 (+) -alpha-2 giardine me te pcDNA3.1 (+) -alpha -7.3 giardin i whakawhitia ki nga macrophages peritoneal kiore tuatahi me te DNA plasmid recombinant, me nga taumata o te whakapuaki, te waahi, me te oligomerization o nga pūmua mumura matua NLRP3 i whakatauhia.I tenei whakamatautau, i whakamahia te GEV hei roopu whakahaere pai, a ko te roopu maimoatanga kore (PBS anake) ko te roopu maimoatanga whakawhiti pcDNA3.1 (+) ko te roopu kino.I whakaatuhia e nga hua, penei i roto i te roopu GEV, ko te DNA plasmid recombinant o giardin pcDNA3.1 (+) -alpha-2 me te giardin pcDNA3.1 (+) -alpha-7.3 i hua ki te whakatikatika i te NLRP3, pro-IL-1β me procaspase-1 me te caspase-1 whakahohenga (Fig. 2a).I tua atu, ko nga giardines e rua i whakauru i te IL-1β nui (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.1000; alpha-2 giardine: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.0007 ).;alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P<0.0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.0047) (Whakaahua 2b).Ko te nuinga o nga pūmua ASC he monomeric i roto i te roopu kore-maimoatanga, i roto ranei i te roopu maimoatanga i whakawhitia me te pcDNA3.1 (+) plasmid, he rereke ki te pcDNA3.1 (+) -alpha-2 ranei pcDNA3.1 (+) -alpha- 7.3 giardine.Ko te oligomerization ASC i puta i roto i te DNA plasmid recombinant o te roopu whakahaere pai GEV, roopu ranei, e whakaatu ana i te ahua oligomeric (Whakaahua 2c).Ko enei raraunga tuatahi e kii ana ka taea e alpha-2 giardine me alpha-7,3 giardine te whakaoho i te mumura o te NLRP3.Ko nga rangahau immunofluorescent i muri mai o te waahi o te ASC me te NLRP3 i whakaatu i roto i te roopu whakahaere kino, i marara te pūmua ASC puta noa i te cytoplasm ka puta hei tohu tohu i runga i te whakaongaonga o te pcDNA3.1 (+) -alpha-2 me te giardine, te pcDNA3 ranei.1(+)-alpha-7,3 rōpū giardine or GEV rōpū whakahaere pai (Whakaahua 2d).I roto i te mana kino me nga roopu pcDNA 3.1 e tukinotia ana e te plasmid, kaore i kitea te tohu o te pūmua NLRP3, i te mea he tohu tohu rererangi i te whakautu ki te pcDNA3.1 (+) -alpha-2 giardine or pcDNA3.1 (+) -alpha-7.3 i kitea..Ka kitea te giardine i roto i te cytoplasm ranei i runga i te whakaongaonga o te HEV (Fig. 2e).Ko enei raraunga ka whakaatu ake ko te G. duodenalis giardin alpha-2 me te giardin alpha-7.3 e whakahohe ana i te mumura NLRP3 i roto i nga macrophages peritoneal tuatahi kiore.
Ko te pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin me te pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin te whakahohe i te mumura NLRP3 i roto i nga macrophages peritoneal kiore.Whakawhitihia te recombinant eukaryotic expression plasmids pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin me pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin ki roto i nga macrophages peritoneal murine tuatahi me nga pūtau, ka hauhake ranei i te supernatant i roto i te 24 haora mo te tātaritanga o te whakapuaki, oligomerization , hunanga.me te waahi o nga pūmua mumura matua.Ko te roopu PBS-anake (C) me te pcDNA3.1 (+) te roopu maimoatanga kotahi i whakamahia hei mana kino, a ko te roopu maimoatanga GEV i whakamahia hei roopu pai.a Key inflammatory proteins NLRP3, tae atu ki te NLRP3, pro-IL-1β, pro-caspase-1, me te p20 caspase-1, i kitea e te Western blotting.b Ko nga taumata o te hunanga o te IL-1β i roto i nga supernatants i whakatauhia ma te whakamahi i te enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).Ko nga rereketanga i waenga i nga roopu whakahaere me nga roopu whakamatautau i tātarihia e te waahanga kotahi-ara o te rereketanga (ANOVA) ma te whakamahi i te putanga rorohiko SPSS 22.0.Ko nga wheturangi e whakaatu ana i nga rereketanga nui i waenga i nga roopu ** P<0.01 me ***P<0.001.c Ko nga taumata oligomerization ASC i roto i nga pire i whakatauhia e te DSS cross-linking analysis, i whakamahia nga taumata ASC i roto i nga lysates pūtau hei mana uta.d Te whakakitenga o te ISC localization ma te whakamahi i te immunofluorescence.I whakamahia te Immunofluorescence ki te tiro i te waahi o te NLRP3.ASC, te pūmua rite ki te kowhatu apoptotic;IL, interleukin;NLRP3, nucleotide-binding oligomerization-like receptor 3;ns, ehara i te mea nui (P > 0.05)
Ko te G. duodenalis me nga GEV e huna ana ka whakahohe i te NLRP3 inflammasome me te whakahaere i nga urupare inflammatory a te ope i roto i te vitro.Na, ko te mahi a te NLRP3 inflammasome i roto i te pathogenicity o G. duodenalis kei te noho tonu.Hei tirotiro i tenei take, i hangaia e matou he whakamatautau i waenga i nga kiore i pangia e te G. duodenalis cyst me nga kiore i pangia e te G. duodenalis cyst + MCC950 maimoatanga aukati me te whakataurite i te whakaaturanga inflammasome NLRP3 i te wa i pangia e te G. duodenalis cyst.Ka whakaatuhia he mahinga taipitopito o te whakamatautau i te Whakaahua 3a.Ko nga huringa o te taumaha o te tinana o nga kiore i roto i nga roopu maimoatanga rereke i tirotirohia mo nga ra 7 i muri i te mate o te mate kiore, a ka whakaatuhia nga hua i te Whakaahua 3b.I whakaritea ki te roopu i tukinotia ki te PBS parakore, i kitea e nga hua ko (i) te taumaha o te tinana o nga kiore i pangia e te G. duodenalis cyst i heke mai i te ra 3 ki te ra 7 i muri i te mate;(ii) ko te maimoatanga me te aukati MCC950 kaore he painga nui ki te taumaha tinana o nga kiore..I whakaritea ki te roopu mate kotahi, ko te BW o te roopu mate duodenal i tukinotia ki te MCC950 kua heke ki nga nekehanga rereke (Ra 1: ANOVA, F (3, 24) = 1.885, P = 0.0148; Ra 2: ANOVA, F (3, 24) ) = 0.4602, P<0.0001; Ra 3: ANOVA, F(3, 24) = 0.8360, P = 0.0010; (3, 24)=0.6497, P=0.0645; Ra 6: ANOVA, F(3, 24)=5.457, P=0.0175;Ko enei raraunga e whakaatu ana ko te NLRP3 inflammasome e tiaki ana i nga kiore mai i te mate taimaha nui i nga waahanga tuatahi (2-4 ra) o te mate duodenal.Na ka whai matou ki te kite i nga G. duodenalis trophozoites i roto i te wai horoi duodenal ka whakaatuhia nga hua ki te Whakaahua 3c.Ka whakaritea ki te roopu mate pukupuku G. duodenalis cyst, ka tino piki ake te maha o nga trophozoites i roto i te duodenum i muri i te aukati i te NLRP3 inflammasome (t (12) = 2.902, P = 0.0133).Ko nga kopa duodenal kua pokea ki te HE i whakaatu, ka whakatauritea ki te mana kino i tukuna ki te PBS me te MCC950 anake: ​​(i) Ko te mate o te G. duodenalis cyst i kino ai te pukoro duodenal (ANOVA, F(3, 24)=0.4903, P= 0.0488 ) me te atrophy crypt (ANOVA, F(3, 24) = 0.4716, P = 0.0089);(ii) duodenum mai i nga kiore i pangia e te G. duodenalis cysts me te rongoa ki te aukati MCC950.i pakaru nga pire duodenal me te mate (ANOVA, F (3, 24) = 0.4903, P = 0.0144) me te atrophy me te manga crypt (ANOVA, F (3, 24) = 0.4716, P = 0, 0481) (Fig. 3d- f).Ko enei hua e whakaatu ana ko te NLRP3 inflammasome he mahi ki te whakaiti i te pathogenicity o G. duodenalis.
Te mahi a te NLRP3 inflammasome i te mate Giardia duodenum.I werohia nga kiore (iv) ki te koto duodenococcal, katahi ka rongoatia me te kore MCC950 (ip) ranei.Ko nga roopu maimoatanga kotahi me te PBS me te MCC950 i whakamahia hei mana whakahaere.Rōpū whakamatautau me te tikanga maimoatanga.b Ko te taumaha o te tinana o nga kiore i roto i ia o nga momo roopu maimoatanga i tirotirohia mo nga ra 7.Ko te rereketanga i waenga i te roopu mate G. duodenalis me te roopu maimoatanga mate G. duodenalis + MCC950 i tātarihia e te whakamatautau-t ma te whakamahi i te putanga rorohiko SPSS 22.0.Ko nga wheturangi e whakaatu ana i nga rereketanga nui i *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 ranei.c I whakatauhia te uta parasitic ma te tatau i te maha o nga trophozoites i roto i te wai horoi duodenal.Ko te rereketanga i waenga i te roopu mate G. duodenalis me te roopu maimoatanga mate G. duodenalis + MCC950 i tātarihia e te whakamatautau-t ma te whakamahi i te putanga rorohiko SPSS 22.0.Ko nga wheturangi e whakaatu ana i nga rereketanga nui i *P <0.05.d Hematoxylin me te eosin (H&E) nga hua whakapouri o te histopathology duodenal.Ko nga pere whero e tohu ana i te kino o te villi, ko nga pere matomato e tohu ana i te kino o nga crypts.Pae tauine: 100 µm.e, f Te wetewete tatauranga mo te teitei duodenal villus me te teitei crypt kiore.Ko nga wheturangi e whakaatu ana i nga rereketanga nui i * P<0.05 me ** P<0.01.Ka tangohia nga hua mai i nga whakamatautau koiora motuhake e 7.BW, taimaha tinana;ig, ara tuku i roto i te kopu;ip, ara tuku i roto i te peritoneal;ns, ehara i te mea nui (P > 0.05);PBS, phosphate buffered saline;WT, momo mohoao
Ko te hunanga o te IL-1β he tohu mo te whakaoho o te mumura.Hei whakatau mehemea ka whakahohehia e te G. duodenalis alpha-2 giardine me te alpha-7.3 giardine te NLRP3 host inflammasome i roto i te vivo, i whakamahia e matou nga kiore WT (sham group) me nga kiore NLRP3 inflammasome-aukati (MCC950 te roopu maimoatanga aukati).Ka whakaatuhia he kaupapa taipitopito o te whakamatautau i te Whakaahua 4a.Ko nga roopu whakamatautau ko nga kiore i tukuna ki te PBS, G. duodenalis cyst treatment by gavage, intramuscular injection of pcDNA3.1, and intramuscular injection of pcDNA3.1(+) -alpha-2 giardine or pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine.I te ra 7 i muri i te whakahaerenga intramuscular o te plasmid recombinant, ka kohia te serum ka whakatauhia te taumata o te IL-1β i ia roopu.Ka whakaatuhia i te Whakaahua 4b, i roto i te roopu MOCK: (i) i whakaritea ki te roopu PBS, kaore he painga nui o te maimoatanga pcDNA3.1 ki te IL-1β secretion (ANOVA, F (4.29) = 4.062, P = 0.9998), engari, Ko te IL-β secretion i tino whakanuia i roto i te G. duodenalis cyst group (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.0002), (ii) pcDNA3.1-alpha-2 giardine me pcDNA3.1- Intramuscular injection of alpha-7.3 giardine i tino piki ake te serum IL-1β (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P<0.0001);(iii) Ko te pcDNA3.1-alpha-7,3 giardine i whakaawe i nga taumata teitei o te IL -1β secretion i roto i te roopu pcDNA3.1-alpha-2 giardine intramuscular injection group (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.0333) .Ka whakatauritea ki ia roopu i roto i te roopu maimoatanga MCC950 me te roopu MOCK: (i) Ko nga taumata huna o te IL-1β i roto i te roopu whakahaere PBS me te roopu whakahaere pcDNA3.1 kua heke ki tetahi waahanga i muri i te aukati i te aukati MCC950, engari kaore i rereke te rereketanga. nui (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.4912 pcDNA3.1: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.5949);(ii) i muri i te aukati i te MCC950., I tino whakahekehia te hunanga IL-1β i roto i te roopu G. duodenalis cyst-infected, te roopu pcDNA3.1-alpha-2 giardine, me te roopu pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine (G. duodenalis: ANOVA, F(9 , 58) = 3.540 , P = 0.0120; pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(9, 58) = 3.540, P = 0.0447; ) = 3.540, P = 0.0164).Ko enei hua e tohu ana ko te alpha-2 giardine me te alpha-7.3 giardine te takawaenga i te whakahohenga o te NLRP3 inflammasome in vivo.
Ko te pcDNA3.1 (+) -giardines ka whakahohe i te NLRP3 host inflammasome i roto i te vivo.I werohia nga kiore (IM) ki te recombinant eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine or pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine katahi ka tukuna ki te MCC950 (ip; MCC950 group) kaore ranei (rōpū puhoi. ).Ko te PBS or pcDNA3.1 (+) te roopu maimoatanga plasmid i whakamahia hei mana kino, ko te G. duodenalis cyst te roopu maimoatanga i whakamahia hei mana pai.Rōpū whakamatautau me te tikanga maimoatanga.b Ko nga taumata serum o te IL-1β i roto i nga kiore i whanganga i te ra 7 e te whakamatautau ELISA.Ko nga rereketanga i waenga i nga roopu o te roopu MOCK i tātarihia ma te whakamahi i te ANOVA kotahi-ara, me nga rereketanga i waenga i te roopu MOCK me te roopu MCC950 i tātarihia ma te whakamahi i te whakamatautau-t o te putanga rorohiko SPSS 22.0.Ko nga wheturangi e whakaatu ana i nga rereketanga nui i waenga i nga roopu maimoatanga i te roopu MOCK, * P<0.05 me *** P<0.001;Ko nga tohu taara ($) e tohu ana i nga rereketanga nui i waenga i ia roopu o te roopu MOCK me te roopu MCC950 i te P<0.05.Nga hua o nga whakamatautau koiora motuhake e whitu.i, werohia ki roto i te uaua, ns, ehara i te mea nui (P > 0.05)
Hei tirotiro i te paanga o te alpha-2 me te alpha-7.3 giardine-mediated activation o te NLRP3 host inflammasome i runga i te G. duodenalis infectivity, i whakamahia e matou nga kiore WT C57BL/6 me te werohia te alpha-2 giardine me te alpha-7.3 giardine.i werohia te plasmid i roto i te uaua, i muri i nga ra e 3 i roto i te ngongo pekitipi o te G. duodenalis cyst, i muri mai ka tirohia nga kiore mo nga ra e 7.Ka whakaatuhia he mahinga taipitopito o te whakamatautau i te Whakaahua 5a.Ko te taumaha o te tinana o ia kiore i whanganga ia ra, ka kohia nga tauira o te kiko duodenal hou i te 7 o nga ra i muri i te whakahaeretanga ma te ngongo pekiti, ka inehia te maha o nga trophozoites, ka kitea nga huringa histopathological.E whakaatu ana i te Whakaahua 5b, me te piki haere o te wa whangai, ka piki haere te BW o nga kiore i ia roopu.Ko te MT o nga kiore i timata ki te heke i te 3 o nga ra i muri i te whakahaere intragastric o G. duodenalis cysts, katahi ka piki haere.Ko te whakahohenga o te NLRP3 inflammasome na te werohanga intramuscular o te alpha-2 giardine me te alpha7.3 giardine i tino whakahekehia te mate taimaha i roto i nga kiore (Ra 1: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 1.399, P = 0 .9754 Ra 1: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30)=1.399, P=0.9987 Ra 2: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.3172, P = 0.9979; Ra 2: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.3172, P = 0.8409; Ra 3 : pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, (Fardine). 4, 30) = 0.8222, P = 0.0262 Ra 3: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.8222, P = 0.0083 Ra 4: pcDNA3.1-alpha-2 giardine , F(4, 30) = 0.5620, P = 0.0012, Ra 4: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5620, P <0.0001, Ra 5: pcDNA3.1-alpha - 2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P <0.0001 Ra 5: pcDNA3.1-alpha -7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P <0.0001 Ra 6: pcDNA3 . alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.7154, P = 0.0012, Ra 6: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.7154, P = 0.0006;Ra 7: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P<0.0001 Ra 7: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P <0.0001).I aromatawaihia te kawenga parasitic i roto i te duodenum (Fig. 5c).I whakaritea ki te mana pai kaore i tukuna me te roopu i werohia ki te vector pcDNA3.1 kau, kua tino heke te maha o nga G. duodenalis trophozoites i roto i nga roopu i werohia ki te α-2 giardine me te α-7,3 giardine (pcDNA3.1-alpha). -2 giardine : ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P = 0.0002, pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P<0.0001).I tua atu, ko te giardine alfa-7.3 he nui ake te tiaki i nga kiore i te giardine alfa-2 (ANOVA, F (3, 24) = 1.209, P = 0.0081).Ko nga hua o te whakapouri HE kua whakaatuhia ki te piki.5d–f.Ko nga kiore i werohia ki te alpha-2 giardine me te alpha-7.3 giardine he iti ake nga whara o te kiko duodenal, ka kitea e te kino o te villus, ka whakaritea ki nga kiore i werohia ki te G. duodenalis me nga kiore i werohia ki te G. duodenalis i te whakakotahi me te pcDNA3 vector .1 Topa.(pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0.0035 or P = 0.0068; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0.0028 ranei P = 0.0055) me te whakaheke i te atrophy crypt (pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1.470, P = 0.0264 ranei P = 0.0158; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine , F(3, 24) = 1.470, P = 0.0371 ranei P = 0.0191).Ko enei hua e whakaatu ana ko te alpha-2 giardine me te alpha-7,3 giardine te whakaiti i te mate o G. duodenalis ma te whakahohe i te NLRP3 inflammasome i roto i te vivo.
Te mahi a te pcDNA3.1 (+) -giardins i te mate G. duodenalis.I werohia nga kiore (IM) ki te recombinant eukaryotic expression plasmids pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine or pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine katahi ka werohia ki te G. duodenalis cysts (ig).Ko te roopu PBS me te pcDNA3.1(+) + duodenal cyst maimoatanga roopu i whakamahia hei roopu whakahaere kino, a ko te roopu maimoatanga o te kopu duodenal i whakamahia hei roopu whakahaere pai.Rōpū whakamatautau me te tikanga maimoatanga.b Ko te MT o nga kiore i ia o nga momo maimoatanga i aroturukihia mo nga ra 7 i muri i te wero.Ko nga wheturangi e whakaatu ana i nga rereketanga nui i waenga i nga roopu i te roopu G. duodenalis me te roopu pcDNA3.1 (+) -alpha-2 giardine, * P <0.05, ** P <0.01, me *** P <0.001;ko te tohu taara ($) e tohu ana i te rereketanga nui i waenga i ia roopu o G. duodenalis me te roopu pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 jardine, $$P<0.01 me te $$$P<0.001.c I whakatauhia te kawenga Parasitic ma te tatau i te maha o nga trophozoites i roto i te 1 ml o te horoi o te duodenal mai i te duodenum (3 cm te roa) ka whakaatuhia ko te maha o nga pirinoa mo ia cm o te duodenum.Ko nga rereketanga i waenga i te roopu mate G. duodenalis, te roopu pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine, me te roopu pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine i tātarihia e te ANOVA kotahi-ara ma te whakamahi i te putanga rorohiko SPSS 22.0.Ko nga wheturangi e whakaatu ana i nga rereketanga nui i ** P<0.01 me *** P<0.001.d Nga huringa histopathological i roto i te duodenum.Ko nga pere whero e tohu ana i te kino o te villi, ko nga pere matomato e tohu ana i te kino o nga crypts.Pae tauine: 100 µm.e, f Te tātari tatauranga mo te teitei o te kiore duodenal villus (e) me te teitei o te crypt (f).Ko nga rereketanga i waenga i nga roopu i te Whakaahua 1d i tātarihia e te ANOVA ara kotahi ma te whakamahi i te putanga rorohiko SPSS 22.0.Ko nga wheturangi e whakaatu ana i nga rereketanga nui i * P<0.05 me ** P<0.01.Nga hua o nga whakamatautau koiora motuhake e whitu.ns, ehara i te mea nui (P > 0.05)
Ko te Giardia duodenum he pirinoa intestinal rongonui o te tangata me etahi atu momo whakangote ka puta te giardiasis.I roto i te 2004, i whakauruhia ki roto i te WHO Neglected Diseases Initiative na te nui o te mate i roto i nga tau 6, ina koa i nga hapori he iti te mana ohaoha [32].Ka whai wāhi nui te punaha raupatu o roto ki te urupare aukati ki te mate G. duodenalis.Kua korerotia nga macrophages kiore ki te horomi me te patu i a G. duodenalis ma te tuku mahanga extracellular [33].Ko o maatau rangahau o mua i whakaatu ko G. duodenalis, he parapara extracellular kore-invasive, ka whakahohe i te p38 MAPK, ERK, NF-κB p65, me te NLRP3 nga huarahi tohu tohu inflammatory i roto i nga macrophages kiore ki te whakahaere i nga urupare inflammatory a te ope, me te tuku GEV ka taea te whakanui i tenei tukanga.13], 24].Engari, ko nga PAMP tika e uru ana ki te NLRP3 inflammasome-regulated mumura i roto i te GEV me te mahi o te NLRP3 inflammasome i roto i te giardiasis ka noho tonu ki te whakamarama.Hei whakamarama i enei patai e rua, i whakahaerehia e matou tenei rangahau.
Ko te NLRP3 inflammasome kei roto i te cytoplasm o nga pūtau aukati ka taea te whakahohe e nga momo matūriki penei i te kiripiri waikawa uric, te paitini, te huakita, te huaketo, me te parapara.I roto i nga rangahau huakita, kua tautuhia nga paitini hei PAMP matua e whakahohe ana i nga pukoro inflammatory, e arahi ana ki te mumura me te mate o te pūtau [34].Ko etahi paitini rereke rereke, penei i te hemolysin mai i te Staphylococcus aureus [35] me te Escherichia coli [36], te hemolysin BL (HBL) mai i te enterotoxin (NHE) [37], ka whakaohooho i te mumura o te NLRP3.Kua whakaatuhia e nga rangahau huaketo ko nga pūmua kino penei i te pūmua SARS-COV-2 (E) pūmua [38] me te huaketo Zika NS5 pūmua [39] he PAMP nui e mohiotia ana e te kaiwhakawhiwhi NLRP3.I roto i nga rangahau parapara, he maha nga pirinoa kua korerohia e pa ana ki te whakahohenga inflammasome ope, penei i te Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41], me Leishmania [42].Ko nga pūmua granule matotoru GRA35, GRA42, me te GRA43, e pa ana ki te kino o Toxoplasma gondii, e hiahiatia ana mo te whakauru o te pyroptosis i roto i nga macrophages kiore Lewis [43].I tua atu, kua arotahi etahi rangahau Leishmania ki nga ngota takitahi e uru ana ki te NLRP3 inflammasome, penei i te parasite membrane lipophosphoglycan [44] me te zinc metalloprotease [45].I roto i te whanau alpha-giardin-a-annexin-rite o nga ira, kua whakaatuhia ko alpha-1 giardin he kaitono kano kano hei tiaki i a G. duodenalis i roto i te tauira kiore [18].I roto i ta maatau rangahau, i tohua e matou nga tohu G. duodenalis virulence alpha-2 me alpha-7,3 giardines, he mea ahurei ki te giardia engari he iti rawa te korero.Ko enei ira e rua kua tohua ki roto i te pcDNA3.1(+) eukaryotic expression system vector mo te tātaritanga o te whakahohenga mumura.
I roto i ta maatau tauira kiore, ko nga kongakonga caspase kua mawehea hei tohu mo te whakahoahohe mumura.I runga i te whakaihiihi, ka taunekeneke a NLRP3 me te ASC, ka tango i nga procaspases, ka whakaputa i nga caspases kaha e tarai ana i te pro-IL-1β me te pro-IL-18 ki te IL-1β me te IL-18 pakeke, -18.Ko nga caspases mumura (caspases-1, -4, -5 me -11) he whanau kua tiakina o te cysteine ​​​​proteases he mea tino nui mo te whakamarumaru o roto me te whai waahi ki te mumura me te mate o te pūtau kua whakaritea [46].Ko te Caspase-1 ka whakahohehia e te inflammasomes canonical [47], i te wa e pakaruhia ana nga caspases-4, -5, me -11 i te wa o te hanganga o nga inflammasomes atypical [48].I roto i tenei rangahau, i whakamahia e matou nga macrophages peritoneal kiore hei tauira me te tirotiro i te p20 caspase-1 kua pakaruhia te caspase-1 hei tohu mo te whakaurunga mumura o te NLRP3 i roto i nga rangahau o te mate G. duodenalis.I kitea e nga hua he maha nga alpha-giardins te kawenga mo te whakakorikori angamaheni o te mumura, e rite ana ki te kitenga o nga ngota ngota taikaha matua e uru ana ki nga huakita me nga wheori.Engari, ko ta matou rangahau he mata tuatahi noa iho, a, tera ano etahi atu ngota ka taea te whakahohe i nga inflammasomes kore-matarohia, i te mea i kitea e to maatau rangahau o mua nga mumura tawhito me te kore-mataro i roto i te mate G. duodenalis [13].Hei whakatau ake mena kei te hono te p20 caspase-1 ki te inflammasome NLRP3, ka whakawhitia e matou te alpha-2 me te alpha-7.3 giardins ki roto i nga macrophages peritoneal kiore hei whakatau i nga taumata whakaputanga pūmua matua me nga taumata oligomerization ASC, e whakau ana ka whakahohe nga α-giardins e rua. mumura NLRP3.He paku rereke o tatou hua mai i a Manko-Prykhoda et al., nana nei i kii ko te whakaongaonga o nga kamera Caco-2 me nga riu G. muris ranei E. coli EPEC anake ka taea te whakanui ake i te kaha o te rere o te NLRP3, ASC, me te caspase-1, ahakoa ehara i te mea nui, me pehea te whakanui ake o te costimulation o G. muris me E. coli i nga taumata o nga pūmua e toru [49].Ko tenei rereketanga pea na nga rereketanga o te kowhiringa o nga momo Giardia, nga raina pūtau, me nga pūtau tuatahi.I mahi ano matou i roto i nga whakamatautau vivo ma te whakamahi i te MCC950 i roto i nga kiore WT C57BL / 6 wahine 5-wiki-pakeke, he pai ake ki te G. duodenalis.Ko te MCC950 he kaha me te kowhiria te aukati ngota ngota iti NLRP3 e aukati ana i te whakahoahoatanga o te NLRP3 kano me te kore-kanoni i nga kohinga nanomolar.Ka whakakorehia e te MCC950 te whakahohenga NLRP3 engari kaore e pa ki te whakahohenga o AIM2, NLRC4, me nga huarahi inflammatory NLRP1 ranei nga tohu tohu TLR [27].Ka aukati a MCC950 i te whakahohenga NLRP3 engari kaore i te aukati i te tiimata o te NLRP3, te K+ efflux, te urunga o Ca2+, te taunekeneke ranei i waenga i te NLRP3 me te ASC;engari, ka whakakorehia te NLRP3 inflammasome activation ma te aukati i te oligomerization ASC [27].Na reira, i whakamahia e matou te MCC950 i roto i te rangahau in vivo ki te whakatau i te mahi a te NLRP3 inflammasome i muri i te werohanga giardine.Ko te caspase-1 p10 kua whakahoahohia ka tarai i nga cytokines pro-inflammatory pro-IL-1β me te pro-IL-18 ki te IL-1β me te IL-18 pakeke [50].I roto i tenei rangahau, ko nga taumata serum IL-1β i roto i nga kiore kua tukinotia ki te giardine me te kore ranei o te MCC950 i whakamahia hei tohu mo te mahi o te NLRP3 inflammasome.Ka rite ki te tumanako, ko te maimoatanga MCC950 i tino whakahekehia nga taumata IL-1β serum.Ko enei raraunga e tino whakaatu ana ka taea e G. duodenalis giardin alfa-2 me giardin alfa-7.3 te whakahohe i te kiore NLRP3 inflammasome.
Ko nga raraunga nui i whakaemihia i roto i nga tau tekau kua pahure ake nei kua whakaatu ko IL-17A te kaiwhakahaere matua o te mate ki a G. muris, te whakaawe i te tohu IL-17RA, te whakaputa i nga peptides antimicrobial, me te whakahaere i te whakakorikori whakauru [51].Engari, ka nui ake te mate o Giardia i roto i nga taiohi pakeke, a kua korerohia ko te mate Giardia i roto i nga kiore taitamariki e kore e whakahohe i te urupare IL-17A ki te whakapau i tana paanga tiaki [52], ka akiaki nga kairangahau ki te rapu i etahi atu Giardia immunomodulatory.nga tikanga o te mate helminth.Ko nga kaituhi o te rangahau tata nei i kii ka taea e G. muris te whakahohe i te NLRP3 inflammasome na E. coli EPEC, e whakatairanga ana i te hanga o nga peptides antimicrobial me te whakaiti i tona kaha whakauru me te maha o nga trophozoites i roto i te waahanga intestinal, na reira ka whakaiti i te kaha o te koroni. nga mate na te bacilli [49].Ko te NLRP3 inflammasome e uru ana ki te whakawhanaketanga o nga momo mate.Kua whakaatuhia e nga rangahau ko te Pseudomonas aeruginosa te whakaoho i te autophagy i roto i nga macrophages ki te karo i te mate o te pūtau, a ko tenei tukanga e whakawhirinaki ana ki te whakahohe o te NLRP3 inflammasome [53].Mo te N. caninum, ko te whakahohenga o nga momo hāora reactive o te NLRP3 inflammasome ka whakawhäitihia tana tukuruatanga i roto i te kaihautu, ka waiho hei kaupapa rongoa pea [9].Kua kitea te Paracoccidioides brasiliensis ki te whakaohooho i te NLRP3 inflammasome i roto i nga pūtau dendritic i ahu mai i te wheua wheua wheua, ka puta mai te tukunga o te cytokine inflammatory IL-1β, he mea tino nui ki te tiaki i te ope [10].He maha nga momo Leishmania, tae atu ki te L. amazonensis, L. major, L. braziliensis, me L. infantum chagasi, ka whakahohe i te NLRP3 me te caspase-1 e whakawhirinaki ana ki te ASC i roto i nga macrophages, me te mate Leishmania.Ka whakanuia te tukurua Parasite i roto i nga kiore ngoikore i roto i te ira NLRP3/ASC/caspase-1 [11].Zamboni et al.Kua korerohia te mate Leishmania ki te whakakorikori i te NLRP3 inflammasome i roto i nga macrophages, e whakaiti ana i te tukuruatanga parapara intracellular.Na, ka taea e Leishmania te aukati i te whakahohenga NLRP3 hei rautaki karo.I roto i nga rangahau vivo, ko te NLRP3 inflammasome i uru ki te whakakore i te Leishmania, engari kaore i pa ki nga kopa [54].Engari, i roto i nga rangahau helminthiasis, ko te whakahohenga o te NLRP3 inflammasome i pehia te mate o te kaihautu ki te helminthiasis gastrointestinal [12].Ko Shigella tetahi o nga huakita nui e pa ana ki te mate pukupuku puta noa i te ao.Ka taea e enei huakita te whakaputa i te IL-1β na roto i te P2X7 kaitakawaenga K+ efflux, momo hāora reactive, waikawa lysosomal, me te kino mitochondrial.Ko te NLRP3 inflammasome e whakahaere kino ana i te phagocytosis me te mahi bactericidal o macrophages ki a Shigella [55].Kua whakaatuhia e nga rangahau Plasmodium ko nga kiore AIM2, NLRP3, caspase-1 ranei kua pangia e te Plasmodium te whakaputa i nga taumata teitei o te momo 1 interferon me te kaha ake ki te mate Plasmodium [56].Engari, ko te mahi a te alpha-2 giardine me te alpha-7.3 giardine i roto i te whakaohooho pathogenic o te mumura NLRP3 i roto i nga kiore kaore i te marama.
I roto i tenei rangahau, ko te whakakore i te NLRP3 inflammasome e MCC950 i whakaitihia te BW me te whakanui ake i te maha o nga trophozoites i roto i te wai horoi intestinal i roto i nga kiore, ka nui ake nga huringa pathological i roto i te kiko duodenal.Ko te Alpha-2 giardine me te alpha-7.3 giardine te whakahohe i te kiore NLRP3 inflammasome, te whakanui ake i te taumaha o te tinana kiore, te whakaiti i te maha o nga trophozoites i roto i te wai horoi intestinal, me te whakaiti i nga mate o te duodenal pathological.Ko enei hua e whakaatu ana ka taea e G. duodenalis te whakahohe i te NLRP3 host inflammasome ma te alpha-2 giardine me te alpha-7,3 giardine, ka whakaiti i te pathogenicity o G. duodenalis i roto i nga kiore.
Ko te kohinga, ko o maatau hua e whakaatu ana ko te alpha-2 me te alpha-7.3 giardines te whakauru i te whakahohenga o te NLRP3 host inflammasome me te whakaiti i te mate o G. duodenalis i roto i nga kiore.No reira, ko enei ngota ngota he tino whainga mo te aukati i te giardiasis.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.Giardiasis: he tirohanga.No na tata nei ka kitea he mate mate a Pat Inflamm ki nga raau taero.2019;13:134–43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardiasis: he arotake mo te rongoa rongoa.Whakaaro Tohunga o te kai rongoa.2007;8: 1885–902.
Tian Huafeng, Chen Bin, Wen Jianfeng.Giardiasis, te aukati tarukino me te kitenga o nga whaainga hou.Ka pangia nga whaainga tarukino Disord.2010;10:295–302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T, me etahi atu NLRP3 mate pukupuku me nga mate pukupuku.Oxide Med Cell Longev.2020;2020:4063562.
Chen GY, Núñez G. Ko te mahi a te inflammasome i roto i te mate pukupuku me te mate pukupuku.Gastroenterology.2011;141:1986–99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Canonical me atypical NLRP3 inflammasome whakahohenga i te mawhititanga o te kātakí ārai me te gut mumura.mate-mua.2017;8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S, et al.ROS-mediated NLRP3 inflammasome activation is involved in response to N. caninum mate.Vector parapara.2020;13:449.